[发明专利]一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法

说明书

本发明公开了一种利用组织培养技术进行多花黄精种苗快速繁殖的方法。其特征在于包含了外植体选择、消毒等处理、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、愈伤组织分化及不定芽形成、不定芽根的诱导培养、炼苗和移栽等步骤的多花黄精组织培养快速繁殖体系。其显著特征是，以多花黄精顶芽作外植体，用70～75％的酒精和5～18％的NaClO组合消毒，快繁体系污染率可控制在5％以下。依据该快繁体系，6个月内，繁殖系数达80倍左右，即一个顶芽平均可产生80多棵组培苗。后期因可省却愈伤组织诱导过程，愈伤组织能持续分化，从而更利于组培苗的生产。本方法是一种高效、快捷、环境友好的繁殖技术体系，短期内可实现多花黄精良种的规模化生产。

技术领域

本发明涉及药用植物的组织培养技术，尤其涉及多花黄精的组织培养技术，包括外植体选择、消毒等处理、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、愈伤组织分化、不定芽形成、不定芽的生根培养、炼苗和移栽等步骤。

背景技术

黄精是我国传统中药材，为百合科黄精属多年生草本植物。多花黄精是《中华人民共和国药典》2015 年版收藏的黄精属3种原生药之一，又称姜形黄精。其性味甘平，补气养阴，健脾，润肺，益肾。用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干少食，肺虚燥咳，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴等症。

多花黄精的繁殖主要有块茎繁殖和种子繁殖两种。生产上，块茎繁殖主要靠采挖野生块茎为种源进行无性繁殖，繁殖系数低，用量巨大，对自然野生资源构成巨大破坏；同时，连续多代的块茎繁殖，常造成植株内病毒富积而退化，个体生长势逐渐变弱，产量越来越低。种子繁殖时，因种子休眠期长、不易萌发、发芽率低等原因，生长速度不如块茎繁殖方法。组织培养是一种十分有效的快速繁殖手段。应用该方法，可在短期内得到大量的种苗。

迄今，已有多人对多花黄精的组织培养方法进行了研究^[1～5]，研究者多选用地下块茎和块茎之芽点为研究材料，此材料因不可避免地附带大量细菌和真菌，消毒十分困难。因此，上述研究工作无一例外地依赖高效灭菌剂—HgCl₂消毒。但HgCl₂的重金属残留往往会对植物造成伤害，废液的不当处理也会对环境造成危害。因此，这些方法均不适于规模化生产时采用。同时，上述研究结果表明，用上述组织培养方法获得的多花黄精的繁殖系数只有10左右，效率比较低下，意味着使用这些方法进行规模化生产时，成本会居高难下。

发明内容

解决的技术问题：针对现有组培技术存在的不足，本发明提供了一种简便、高效、免HgCl₂消毒的多花黄精外植体消毒方法，同时提供了一整套多花黄精的组织培养技术。

技术方案：一种以顶芽为外植体的多花黄精种苗快速繁殖方法，其特征在于包括以下7个步骤：

(1)外植体的选择；

(2)外植体的消毒；

(3)外植体的处理；

(4)愈伤组织的诱导；

(5)愈伤组织的增殖和分化；

(6)生根培养；

(7)炼苗移栽。

上述步骤(1)方法如下：选择多花黄精的顶芽为外植体，是指于3月下旬至4月上旬，从地下块茎萌动并长出地面5cm以上，干净、无明显污物、嫩叶尚未展开的直立茎尖。用利剪在茎尖以下约3cm处剪切，即得顶芽。此顶芽可进行后续处理；

上述步骤(2)方法如下：将步骤1所得顶芽进行表面消毒，具体方法是：用自来水将顶芽表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用70～75％的酒精浸泡10～30s，优选15～20s；然后用无菌水冲洗一次，再用5～18％的NaClO浸泡3～10min，优选9～15％的NaClO浸泡4～8min；随后用无菌水冲洗三次备用；