[发明专利]苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体构建方法及应用

权利要求书

1.一种苏云金芽胞杆菌vip3Aa11基因的表达T载体的构建方法，其特征在于：该构建方法为:

第一步:构建Linker

合成2条互相配对的核苷酸Linker-F：CACCACGATTCCTATGGAAGGGCCCGCTCGAGAGCCACCGCAATGGTGGG和Linker-R：GATCCCCACCATTGCGGTGGCTCTCGAGCGGGCCCTTCCAGAGGAATCGTGGTGGTAC，分别用水溶解至终浓度为10μmol/L，各取20μL混合，于95℃变性5min，然后按照下述步骤进行复性：85℃3min，65℃3min，45℃3min，37℃3min，25℃3min；

第二步：BamH I，KpnI双酶切pUC19质粒与Linker

反应体系：DNA 3μL、10×酶切buffer 2μL、BamH I 1μL、KpnI 1μL、加ddH₂O至20μL；

反应条件：反应体系混匀后置于37℃酶切4h，取5μl酶切产物电泳检测，条带大小正确，进行测序分析；

第三步：DNA片段的连接、转化

将回收后的载体和PCR产物连接，载体DNA与外源DNA片段的摩尔比＝1：3，反应条件：16℃，4h

取5μL连接产物，转化大肠杆菌JM109；

第四步：重组质粒的鉴定

取转化E.coli JM109的后单克隆，接种液体LB培养基，37℃，220rpm，6h后的菌液为模板，以pUC19通用引物对为引物，PCR扩增插入基因的全长片段；pUC19F和pUC19R为pUC19的引物，

引物pUC19F序列为：GGGTTTTCCCAGTCACGACG，

引物pUC19R序列为：CTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA；

反应体系：2×Taq DNA polymerase Mix 10μL、pUC19F 10μM 1μL、pUC19R 10μM 1μL、菌液1μL加ddH₂O至20μL；

扩增循环：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min；

取3μL扩增产物进行琼脂糖电泳检测120V，30min，阳性克隆大小为184bp，阴性克隆大小为142bp；

第五步：Apa I酶切阳性克隆质粒

反应体系：重组质粒DNA 3μL、10×酶切buffer 2μL、ApaI 1μL、加ddH₂O至20μL；

反应条件：反应体系混匀后置于37℃酶切4h，取5μl酶切产物电泳检测；

第六步：去磷酸化

反应体系50μl，37℃，4h，体系如下：DNA Fragment in TE Buffer 1-20pmol、10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μL、CIAP 2μL、Sterilized distilled water Up to 50μL；

1)、苯酚/氯仿/异戊醇25:24:1抽提2次；

2)、氯仿/异戊醇24:1抽提1次；

3)、1/10体积的3M NaCl，2倍体积的冷乙醇，-20℃下放置60min；

4)、12000rpm，10min；

5)、再加乙醇洗一遍沉淀

6)、用20μL TE Buffer溶解沉淀；

第七步：PCR扩增一段两端带Apa I酶切位点的cry基因片段，引物615F序列为：GGGCCCAGTGATAATAGACAGATTTGAATTTATTCC，引物615R序列为：GGGCCCTCGATTCGGCTCTCCACA，凝胶回收后，通过T4 DNA连接酶与去磷酸化的载体进行连接、转化大肠杆菌JM109，挑取单克隆进行PCR、测序鉴定；

第八步：PCR扩增cry1Ac启动子

以苏云金芽胞杆菌LBH97基因组为模板，以pc1Ac-F、pc1Ac-R为引物对，PCR扩增cry1Ac启动子基因片段；

pc1Ac-F序列为：CGGGATCCGCAGGTAAATGGTTCTAACATGTATAAGTGT

pc1Ac-R序列为：AACTGCAGAAGTTACCTCCATCTCTTTTATTAAGATACC

反应体系：KOD plus 1μl、KOD buffer 5μl、dNTPs 5μl、MgSO₄ 2μl、pc1Ac-F 10μM 1μl、pc1Ac-R 10μM 1μl、Template 1μl、加ddH₂O至50μL；

反应条件：扩增循环：94℃预变性2min；94℃变性20s，55℃退火20s，68℃延伸30s，30个循环，最后68℃延伸10min，取5μl PCR产物电泳检测，正确大小为368bp；

第九步：用限制性内切酶Bam HI和Pst I双酶切PCR扩增后的启动子，凝胶回收后，通过T4 DNA连接酶与第七步中的载体进行连接，转化JM109，经PCR、酶切鉴定后，测序分析；经Apa I酶切后条带大小为619bp、3087bp，经Xcm I酶切后条带大小为323bp、328bp、3055bp；

第十步：回收3055bp条带，即为苏云金芽胞杆菌vip3Aa11基因的表达T载体。