[发明专利]一种单核苷酸多态性位点在辅助鉴定大豆花叶病毒抗性中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及大豆抗病育种和分子生物学技术领域，具体涉及一种与大豆花叶病毒病相关SNP位点的应用及大豆花叶病毒抗性的检测方法。

背景技术

大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus，SMV)是一种世界性大豆病害，对大豆生产影响最大的病毒之一，严重影响大豆的产量和品质。 南京农业大学将我国的SMV株系划分为SC1-SC21， 其中SC3和SC7是黄淮和长江流域大豆产区最流行的株系。大豆花叶病毒分布广、危害大，化学药剂难以防治，培育和筛选抗病品种是解决大豆病毒性的最有效经济途径。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致，但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

大豆基因组虽然早在2010年已经完成测序，但各个基因的功能并没有完全阐明。如果能从中找出与大豆花叶病毒抗性相关的位点，并利用该位点开发分子标记，利用分子标记辅助育种，将能大大提高育种效率。近年，单核苷酸多态性（SNP）越来越受到科研人员的重视，同时也发现许多SNP与作物的重要农艺性状和抗性具有一定的关联性， 程浩（2008）博士毕业论文（大豆异黄酮合酶，黄烷酮3-羟化酶基因SNPs与种子异黄酮含量及抗逆性的关联分析）报道称大豆IFS1, IFS2和F3H基因中都存在与大豆对花叶病毒抗性显著相关的SNPs。 如IFS1基因中与大豆对SMV Sc-3与 SMV Sc-7抗性显著相关的SNPs分别为14和2个； 在IFS2基因中发现与大豆对SMV Sc-3与 SMV Sc-7抗性显著相关的为Indel(1 bp)。在F3H基因中发现与大豆对SMV Sc-3 和Sc-7抗性显著相关的SNPs为7个和1个。因此，发掘和利用大豆中重要的SNP位点具有重要的现实和理论意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种Glyma.07G250300中与大豆花叶病毒病相关SNP位点发掘及应用，本发明的目的可以通过以下技术实现：

一种单核苷酸多态性位点在辅助鉴定大豆花叶病毒抗性中的应用，该点位于大豆基因组Glyma.07G250300基因编码区开放阅读框第557位。

进一步，上述单核苷酸多态性位点的应用是指：对大豆基因组Glyma.07G250300基因编码区开放阅读框第557位核苷酸进行基因型鉴定，若第557位核苷酸残基为“A”，则认为大豆材料抗花叶病毒；若第557位核苷酸残基为“G”，则认为大豆材料对花叶病毒敏感。

进一步，上述单核苷酸多态性位点的应用，其具体步骤如下：

1）根据大豆基因组Glyma.07G250300基因编码区内开放阅读框(ORF) 设计上游引物和下游引物，并以大豆基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

2）对PCR扩增产物进行测序，若Glyma.07G250300基因编码区内开放阅读框第557位核苷酸为“A”，则认为大豆材料抗花叶病毒；若第557位核苷酸为“G”，则认为该大豆材料对花叶病毒敏感。

进一步，上述单核苷酸多态性位点的应用中，所述上游引物位于开放阅读框

（5‵→3‵）第71位核苷酸残基开始,第90位核苷酸残基结束;下游引物从开放读框第635位核苷酸残基开始,第657位核苷酸残基结束。

进一步，所述上游引物和下游引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

PCR扩增体系：2×Phanta Max Buffer 25μL；dNTP Mix（10mM each）1μL；上游引物4μL(10μM)；下游引物4μL(10μM)；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μL）；模板DNA 4μL（20ng/μL）；ddH₂O补足到50μL；

PCR 扩增程序：95℃预变性3 min；然后95℃变性15 s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保温；

PCR反应结束后，将所得PCR产物（786bp）进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后测序。