[发明专利]一种植物DNA的简便、快速提取方法

说明书

技术领域

本发明公布了一种植物DNA的简便、快速提取方法，属于分子生物学领域。本发明极大地简化了植物DNA提取方法，该方法简便、快速、稳定性好，可广泛应用于提取分子鉴定所需的各种植物叶片DNA。

背景技术

随着水稻、玉米、小麦等主要农作物全基因组测序的完成，这些经济作物的分子标记开发难度明显下降，利用分子标记进行辅助育种、品种鉴定开始被应用到实际生产之中。但分子鉴定和表观鉴定不同，必须通过DNA提取和鉴定等一系列程序，故而进行大样本筛选时，工作量极大，急需适应高通量筛选要求的方法体系，而这其中最需要优化的就是DNA的提取过程。现有DNA提取方法十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法(Doyle et al.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of frexh leaf tissue.Phytochem Bull.1987,19:11-15.)，需经过研磨、裂解、氯仿抽提、离心、沉淀和清洗等步骤，整个流程需要两小时，可同时操作二十个样品，平均耗时约六分钟，需要用去污剂CTAB、有毒有害的有机溶剂氯仿及大量的乙醇，其间需将样品转管三次，提取效率低，而且对操作的专业程度、细心程度要求较高，不适合高通量操作；现在应用于高通量DNA提取的DNA提取工作站(余婧等.自动化工作站批量提取烤后烟叶DNA方法的建立与应用.贵州农业科学.2015,5:217-219.)，虽然简单便捷，但是需要昂贵的设备、专用试剂，对实验人员的操作要求也比较高；而直接PCR法(Rogers et al.Direct PCR amplification from leaf discs.Plant Sci.1999,143:183-186.)虽然可以省去DNA提取的步骤，但是材料用量对实验结果有显著影响，稳定性难以保证，需要使用扩增效果更好也更加昂贵的酶以及PCR增强试剂，而且每次取样仅能用于一次PCR扩增。所以急需开发一种操作简单方便，稳定性好，不需要特殊设备仪器，也不需使用有毒有害或者昂贵试剂，可大批量同时处理的新DNA提取方法。

本发明公布了一种植物DNA的简便提取方法，使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)为DNA样品提供良好的缓冲条件，保证DNA的稳定性；使用乙二胺四乙酸(EDTA)抑制DNA酶活性，防止细胞破碎后细胞中的DNA酶对DNA进行降解；高温加热，不仅能裂解植物细胞，释放DNA，还能灭活植物细胞释放的各种酶类和附着在植物样品上的微生物；高速离心能够去除非水溶性的细胞碎片等杂质。由于提取物中所添加的较高浓度的EDTA会抑制Taq DNA聚合酶的活性，所以在后续的PCR过程中需要增加相应浓度的镁离子，以中和过多的EDTA，保证PCR正常进行。操作周期约20分钟，批量处理时可达到每人每分钟处理一个样品。只需要EDTA和Tris，后续扩增只需要使用普通的Taq DNA聚合酶。提取每一个样品，试剂成本不到0.01元人民币，而且一次提取可用于多次PCR扩增。其间不需要转管等操作，减少了人为失误。不需要特殊的仪器设备，没有太多的操作要求，这将极大的节约人力和材料成本。本发明在遗传作图、分子标记辅助育种、品种纯度检测、品种的真实性鉴定等领域具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于公布一种植物叶片基因组DNA提取方法，所述的DNA提取方法可满足分子标记筛选的DNA模板需要，且省时、操作容易、设备要求低、成本低、安全无毒无污染。

技术方案：

一种植物DNA的简便、快速提取方法，按照下述步骤进行：

(1)剪取1～2cm²植物叶片置于离心管中，用研磨棒快速研磨得到匀浆；

(2)向所述植物匀浆中加入提取液，70～90℃加热10～15分钟，再经过10000～13000r/min离心1分钟，即得到可直接用于PCR的DNA提取物。

所述提取液由Tris溶液和EDTA溶液组成，其中Tris和EDTA的含量分别为20～50mM和13～25mM，pH 8.0。

所述Tris溶液配制方法如下：0.5M Tris-HCl(200ml)：称取60.55g Tris，溶于100ml蒸馏水中，再用浓盐酸调至pH 8.0，定容至200ml，高温蒸汽灭菌(121℃，20分钟)。低温(4℃)储存。