[发明专利]用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针

权利要求书

1.检测样品中第一和第二靶核酸分子的一个或两者之存在的体外方法，其包括：

(a)将所述样品与至少第一和第二引物组接触，每组引物包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述靶核酸第二链上的区域互补的序列，其中所述第一和第二引物组的报告基团相同，并且其中所述第一和第二引物组包含具有可区分熔链点的发夹；

(b)用所述第一和第二引物组扩增所述靶核酸，其中在淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一和第二引物组之第一引物的非天然核苷酸碱基配对；

(c)通过检测所述报告基团的信号淬灭来检测靶核酸分子的存在；以及

(d)改变所述样品的温度并确定对应于所述报告基团未淬灭时的熔链点或熔链峰，来确定第一靶核酸分子、第二靶核酸分子或两者的存在是否导致所述报告基团的信号淬灭，由此检测所述第一和第二靶核酸分子的一个或两者的存在。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述报告基团为荧光团。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述信号的淬灭为荧光信号的降低。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述淬灭基团为暗淬灭基团。

5.如权利要求1所述的方法，其中改变所述样品的温度包括将所述样品的温度从低于第一和第二引物组中两个第一引物之发夹的熔链点的温度提高至高于两者之发夹熔链点的温度。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个非天然核苷酸和淬灭基团标记的非天然核苷酸中的一个为isoG，另一个为isoC。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二引物组包含发夹熔链点相差2℃至10℃的第一引物。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二引物中的至少一个包含靶特异性序列中的至少一个非天然核苷酸。

9.如权利要求1所述的方法，其还包括：

(a)将所述样品与至少第三、第四、第五或第六引物组接触，每组引物包含第一引物，所述第一引物从5’至3’包含，(i)报告基团；(ii)具有已知熔链点的发夹；(iii)聚合酶延伸-阻断修饰；(iv)至少一个非天然核苷酸，和(v)靶特异性序列，其与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区域互补；以及第二引物，其包含与所述第三、第四、第五或第六靶核酸第二链上的区域互补的序列；

(b)用所述第三、第四、第五或第六引物组扩增第三、第四、第五或第六靶核酸，其中在淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下进行所述扩增，所述非天然核苷酸与所述第一引物的非天然核苷酸碱基配对。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述第一、第二、第三、第四、第五或第六引物组各自包含可区分的报告基团或具有可区分熔链点的发夹。

11.如权利要求10所述的方法，其还包括(c)通过检测所述第三、第四、第五或第六引物组第一引物上的可区分报告基团的信号淬灭，来检测所述第三、第四、第五或第六靶核酸的存在。

12.如权利要求10所述的方法，其还包括(d)当样品温度改变时，通过确定对应于所述报告基团未淬灭的熔链点或熔链峰，来确定所述第三、第四、第五或第六靶核酸的存在。

13.如权利要求12所述的方法，其中同时检测所述第一和第二靶核酸的存在。

14.如权利要求1所述的方法，其还包括进行多重聚合酶链式反应循环。