[发明专利]特异性抑制COL12A1基因表达的siRNA及其重组载体和应用

说明书

本发明公开了一种特异性抑制COL12A1基因表达的siRNA及其重组载体和它在逆转卵巢癌紫杉醇耐药中应用，属于分子生物学与生物医药技术领域。所述siRNA，包括正义链和反义链，正义链：5’‑UCAACUUCUGCCUCAAUGGAA‑3’；反义链：5’‑CCAUUGAGGCAGAAGUUGACC‑3’。本发明提供的siRNA可以特异性、高效地抑制COL12A1基因的mRNA和蛋白表达，减少中肿瘤细胞增殖，增加细胞凋亡，降低肿瘤细胞迁移和侵袭能力，并能有效逆转卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药。本发明还提供了所述siRNA及其重组载体在制备治疗卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌或逆转卵巢癌耐药的药物中的应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种特异性抑制COL12A1基因表达的siRNA及其重组载体和应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是动植物中广泛存在的序列特异性转录后基因沉默机制。1998年美国科学家Andrew Fire在秀丽新小杆线虫C.Elegans体内首次发现将正义链和反义链的混合物(即dsRNA)所产生的基因沉默效应至少10倍于反义核苷酸的抑制作用，而且能在子代中诱导出同样的基因抑制现象。对RNAi现象的机理研究表明，微量siRNA即能通过转录后基因沉默使大量靶RNA沉默，而这种高效、特异降解同源RNA从而导致序列特异性基因沉默的关键性分子是长为21-23碱基的小双链寡核苷酸，也称作小干扰RNA(siRNA)。进一步研究发现短于21bp或者长于25bp的双链RNA均不能有效启动RNAi，而且其中只要有一个碱基错配，基因沉默的效应就明显减退甚至消失，充分体现了siRNA作用的特异性。

显示出强大基因沉默效能的siRNA作为近年来生物技术的重大发现而备受瞩目，正是因为它具有特异性和高效性阻断同源基因的基因抑制功能，是基因功能研究强有力的工具。siRNA具有许多传统方法无法比拟的优势和特点。目前虽然已有一些抑制特定基因表达的方法，如反义RNA、基因敲除(knockout)等，但siRNA显示出了明显优于这些技术的优势：与反义RNA相比，它具有更高的特异性和持续性；与复杂耗时的基因敲除相比，siRNA是更简便有效的手段。目前利用siRNA作为基因沉默的方法被广泛用于恶性肿瘤机制的研究，研究的关键点主要集中在如何提高基因沉默效能，包括靶基因位点选择、导入系统的优化和对宿主细胞功能的影响等，并由此推动了以该技术为基础的肿瘤特异高效靶向治疗策略的研发进程。

卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其病死率居各类妇科肿瘤的首位。卵巢癌治疗最大的障碍是肿瘤细胞耐药性的产生,特别是出现多药耐药。随着铂类/泰素药物联合化疗的实施，卵巢癌的初次化疗反应率可达80％。但大多数患者在2～3年内复发。对复发后卵巢癌，即使再采用作用机制完全不同的化疗药物，也产生耐药，从而使肿瘤治疗后生存率得不到显著的提高。晚期卵巢癌的五年生存率始终徘徊在20～30％。高复发率和复发后的高耐药率是卵巢癌高死亡率最主要的原因之一，寻找卵巢癌化疗耐药的解决方案是目前肿瘤研究的重要课题。

分子靶向药物和化疗联合应用是目前提高恶性肿瘤患者生存率最有前景的治疗方法。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，是由细胞合成并分泌到胞外分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是一些多糖、蛋白或蛋白聚糖，这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织和细胞的生理活动。ECM能结合生长因子等信号分子，启动各种信号传导途径从而调节细胞形态、迁移运动、增殖、分化等功能。恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移常常伴有ECM表达的变化。COL12A1(Collagen alpha-1(XII)chain)，编码胶原蛋白12的alpha链，染色体定位在6q13-q14.1，它是一个由3000多个氨基酸组成的大分子糖蛋白，是组成细胞外基质的重要成分，对细胞生长微环境的维持有着重要的作用。近年来文献报道COL12A1在结直肠癌和乳腺癌中有明显的高表达，是肿瘤细胞发生侵袭转移的主要分子之一，并且和细胞的分化密切相关。