[发明专利]一种多倍PCR扩增方法

权利要求书

1.一种多倍PCR扩增方法，其特征在于：所述方法包括在反应混合物中进行所述扩增，所述反应混合物包含一对多倍引物和一对通用引物，以及具有链替换作用的耐热DNA聚合酶；以较低浓度的多倍引物在最初几个循环引发PCR，产生的第一扩增产物包含多个通用引物序列；以第一扩增产物为模板，使用较高浓度的通用引物扩增PCR，产生包含目标基因的多个第二扩增产物；

所述方法进一步包括步骤：

1)第一扩增反应，多倍引物与模板杂交，产生包含至少两个上游通用引物和一个下游通用引物或至少一个上游通用引物和两个下游通用引物序列的第一扩增产物；

2)第二扩增反应，以第一扩增产物为模板，通用引物与第一扩增产物结合，在具有链替换作用的耐热DNA聚合酶作用下，产生多个包含目标基因序列和至少一个上游通用引物和一个下游通用引物的第二扩增产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，多倍引物浓度为5-100nM；所述多倍引物的3’端与目标基因特异性互补，5’端包含至少1个与通用引物序列相同的结合位点。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，多倍引物的上、下游序列包含的通用引物数相同或不同，但一个体系中多倍引物所包含的通用引物序列总数目至少为3个。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述通用引物浓各为l-10μM；所述通用引物与目标基因序列无同源性；所述通用引物的解链温度与目标基因特异性引物的解链温度相差不超过4℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述通用引物的上、下游的序列相同或不同。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，多倍引物的3’端与目标基因序列完全互补，其序列用引物软件设计，序列长度为10-30碱基，5’端包含至少一个与通用引物完全相同的序列，其序列间用碱基连接。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通用引物序列与目标基因序列无关，其设计完全独立于被测基因；其物序列长度为10-30碱基。