[发明专利]一种检测百合无症病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测百合无症病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

百合无症病毒(Lily symptomles virus，LSV)属于线性病毒科(Flexiviridae)、麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus),是危害百合的主要病毒之一。由美国Brierley和Smith 1944年首次从俄勒冈州带来的坏死斑点的百合中分离得到，此病毒是弯曲的细丝状，长610-700nm，直径12-15nm，螺旋对称结构。病毒基因组为单分子ssRNA，长8394nt，含6个ORF，其中ORF5编码32kD外壳蛋白，基因组RNA 3’端有一个Poly。LSV的传播范围比较狭窄，主要侵染百合科植物，能够被蚜虫以非持续性的方式或者被棉蚜以持续的方式传播，也可以通过花叶的相互接触和汁液接种传播。单独浸染时植株一般不会出现明显的症状，但会使鳞茎变小，严重退化。与其他病毒复合侵染时则可引起严重的田间症状，且对不同的寄主产生相应的症状。当和黄瓜花叶病毒一起复合侵染时在百合中引起坏死斑点。当和郁金香碎色病毒复合侵染时，在鳞茎状百合属植物中引起棕色环斑，在药百合植物叶片中引起碎斑。由于百合种球生产的主要是扦插和分球等无性繁殖方式，百合一旦感染LSV病毒后，在开放的环境中，病毒就会在该范围内积累扩散传播，直接影响了百合的花和球茎质量，严重影响花卉生产的经济效益。

目前，LSV的诊断方法主要有：电镜观察法、血清学检测法和分子生物学检测法，包括免疫吸附电镜法(ISEM)、酶联免疫吸附法(ELISA)、核酸分子杂交技术(PCR)、反转录PCR技术(RT-PCR)以及基因芯片技术等。

电镜观察快速、简单和直接，但电镜操作需要一定技能，而且工作比较集中，样本数量大则不易处理。ISEM技术结合了电镜与血清学技术，利用电镜高度放大率和分辨能力，能直接看到抗原与抗体之间特异性反应和免疫复合物的形态学特征，敏感性高和特异性强。但需要较高倍数的电子显微和高制备样品费用。

ELISA具有灵敏度高、特异性强、安全、快速及容易观察结果等优点。但在样品加工过程中，蛋白质易受破坏而影响检测结果的准确性；操作较繁琐，需要特殊仪器，检测费用高，而且存在着假阳性或假阴性现象。

PCR技术检测专一性强、灵敏度高、特异性好、操作简单，但检测中某些关键性限制因素极易造成假阳性或假阴性结果出现。LSV为RNA病毒，在逆转录的过程中，极易受到RNA酶的污染，出现假阴性。而在PCR过程中样品的非特异性扩增都有可能出现假阳性结果。

RT-PCR具备PCR优点的同时减少了逆转录的步骤，但需要严格的操作环境并且价格相对较高。而且对于携带微量病毒的植物组织，RT-PCR的检测灵敏度还不能达到要求。

此外，基因芯片技术也具备有灵敏性高特异性强的特点，但基因芯片制作昂贵，而且还需高昂价格的激光共聚焦扫描仪。在操作复杂、费时的同时，对操作人员的专业要求较高，使得该技术的推广受到了限制。综上所述，由于百合无症病毒广泛存在于百合花卉市场中，所需检测量大，需寻求一种更加简单高效、经济、快捷的检测方法。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi在2000年提出的一种等温核酸扩增技术，现已被广泛应用。该技术主要依靠一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶(Bacillus stearothermophilus DNA polymerase)和四条能够识别靶序列上六个特异区域的引物，在恒温条件下就能实现目标条带的10⁹-10¹⁰倍扩增。4条引物FIP/BIP、F3/B3需在靶基因上的6个不同部位完全匹配才进行扩展，具有高特异性。

此外，LAMP具高灵敏度，产物检测便捷，且较少受到培养介质和生物学物质的影响，此外，该技术成本低廉，操作简单，极易于在基层推广。

然而，百合无症病毒是RNA单链病毒，容易发生变异，而且不同变异株之间会有许多突变位点，因此，利用LAMP技术检测百合无症病毒的难点在于保守序列的选择和引物的设计，方法灵敏度较高时，还需要严格的防污染措施来避免假阳性结果。

目前，LAMP技术还未被应用于百合无症病毒的检测。

发明内容