[发明专利]一种检测黄瓜花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测黄瓜花叶病毒的LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，从5'端到3'端，具体序列如下：

F3:5'-CCACCCAACCTTTGTAGG-3'；

B3:5'-CGGCAAAGGATTAACTCGA-3'；

FIP:5'-GTCTATTTTTGGTGGCTTTAGGGTTTTTGAGTGAACGCTGTAAACCT-3'；

BIP:5'-CGTGGGTCTTATTATGGTAAAAGGTTTTTATTTGAATGCGCGAAACA-3'。

2.一种包含权利要求1所述LAMP引物组的黄瓜花叶病毒的LAMP检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述黄瓜花叶病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，其包含LAMP反应体系，该LAMP反应体系包括：内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、10×buffer、Mg²⁺、dNTPs、甜菜碱和Bst DNA聚合酶，其中，内引物与外引物的浓度之比为8-16：1。

4.根据权利要求3所述黄瓜花叶病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 0.8-1.6μM，内引物BIP 0.8-1.6μM，外引物F3 0.1-0.2μM，外引物B3 0.1-0.2μM，Mg²⁺1.0-2.0mM，dNTPs 0.2-0.3mM，甜菜碱0.6-1.0M，Bst DNA聚合酶0.26-0.38U/μL，其中，内引物与外引物的浓度比为8-16：1。

5.根据权利要求3所述黄瓜花叶病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP：1.2-1.6μM，内引物BIP：1.2-1.6μM，外引物F3：0.12-0.2μM，外引物B3：0.12-0.2μM，Mg²⁺1.3-1.7mM，dNTPs 0.25-0.3mM，甜菜碱0.6-0.8M，Bst DNA聚合酶0.32-0.38U/μL，其中，内引物与外引物的浓度比为8-16：1。

6.根据权利要求3所述黄瓜花叶病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 1.6μM，内引物BIP 1.6μM，外引物F3 0.2μM，外引物B3 0.2μM，Mg²⁺1.5mM，dNTPs 0.3mM，甜菜碱0.6M，Bst酶0.38U/μL。

7.一种黄瓜花叶病毒的LAMP快速检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品RNA，将总RNA的50ng-5μg用全式基因逆转录试剂盒进行逆转录，获得cDNA；

2)配制LAMP反应体系；

以ddH₂O为阴性对照，以包含黄瓜花叶病毒目的序列的质粒为阳性对照，配制LAMP反应体系；

所述LAMP反应体系中，各成分的终浓度为：内引物FIP 0.8-1.6μM，内引物BIP 0.8-1.6μM，外引物F3 0.1-0.2μM，外引物B3 0.1-0.2μM，10×buffer，MgCl₂ 1.0-2.0mM，dNTPs 0.2-0.3mM，甜菜碱0.6-1M，Bst DNA聚合酶0.26-0.38U/μL，逆转录得到的cDNA模板1μL，其中，内引物与外引物的浓度比为8-16：1；

3)进行LAMP扩增反应

LAMP扩增反应程序为：55-63℃30-60min，80-85℃3-5min；

4)鉴定扩增结果

步骤3)LAMP扩增反应结束后，向扩增产物中加入显色剂SYBR Green I染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有黄瓜花叶病毒；显色为橘色的样品为阴性，不含黄瓜花叶病毒；

或者取LAMP扩增产物，在Goldview染色的琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像仪器的紫外光下显影观察，若出现特征性的梯状条带则样品为阳性，含有黄瓜花叶病毒；若无条带出现则样品为阴性，不含黄瓜花叶病毒。