[发明专利]一种脂肪酶检测试剂盒的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物试剂领域，具体是指一种脂肪酶检测试剂盒的制备方法。

背景技术

脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。主要来源于胰腺，其次为胃及小肠，能水解多种含长链(8-18碳链)脂肪酸的甘油酯。脂肪酶合成于胰腺的腺泡组织，具有较高的器官特异性，胰腺炎发病早期，即可检测到血清脂肪酶浓度的升高，急性胰腺炎是一种临床常见、发病急、病情凶险、病死率高的急腹症，及时抽血检查血清脂肪酶，对诊断、治疗和预后有重要意义。早期检测血清脂肪酶能较好的区分急性和非急性胰腺炎，其血清表达水平和胰腺炎病情进展程度呈显著正相关，有较高的敏感性，是诊断胰腺炎病情的主要监测指标。

目前检测脂肪酶(LPS)的方法主要有PNPB法、pH-Stat法、滴定法及比浊法等。PNPB法、pH-Stat法、滴定法无法配合全自动生化分析仪，不适用于临床诊断；目前大部分LPS检测试剂盒均采用比浊法，该法的缺陷在于对底物的依赖性较大且反应的准确度不高、重复性较差，线性范围较窄。

因此，有必要对此进行改进。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种脂肪酶检测试剂盒的制备方法。通过该方法可制备脂肪酶检测试剂盒，检测试剂盒采用辅酶指示系统的连续监测法，无需样本前处理，可直接利用全自动生化分析仪进行大批量样本检测，操作简单、准确度高、重复性好、线性范围宽，适合临床应用推广。

为实现上述目的，本发明的技术方案是配制浓度为80mmol/L-160mmol/L的缓冲溶液，将PH值调至8.8作为反应溶剂，先加入展开剂组合物，边加边搅拌，转速控制在120r/pm，连续转动15min，之后加入一定量的酶保护剂，待完全溶解后分别加入底物甘油三月桂酸酯100mmol/L-300mmol/L、氧化型辅酶Ⅰ0.2mmol/L-0.4mmol/L、甘油脱氢酶(GDH)0.5KU/L-3KU/L，酶保护剂在加氧化型辅酶Ⅰ之前加入，最后加入防腐剂NaN₃ 0.6g/L-1g/L，待完全混合均匀后置于2-8℃密封保存。

进一步设置是酶保护剂的添加量以5g/L-10g/L计。

进一步设置是展开剂添加量为以该展开剂为液体展开剂

0.4mL-1.6mL/100mL；或该展开剂为固体展开剂0.4g-1.6g/100mL。

进一步设置是所述缓冲溶液为柠檬酸-醋酸镁缓冲液、甘氨酸-醋酸镁缓冲液、咪唑-醋酸镁缓冲液、乙酸-醋酸镁缓冲液或硼酸-醋酸镁缓冲液。

进一步设置是所述的酶保护剂为海藻糖、蔗糖、甘露醇、果糖中的一种或多种组合。

进一步设置是所述的酶保护剂为海藻糖和蔗糖1:1质量比组合。

进一步设置是所述展开剂为吐温-20、吐温-80、脂肪醇聚氧乙烯(7)醚、月桂酸聚氧乙烯(9)酯、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、烷基酚聚氧乙烯(10)醚中的一种或多种组合。

进一步设置是所述展开剂为吐温-80和脂肪醇聚氧乙烯(7)醚1:3体积比组合。

通过本发明的上述方法可以配置脂肪酶检测试剂盒，该脂肪酶检测试剂盒可适用于采用辅酶指示系统的连续监测法，可以确定线性期并计算每分钟吸光度的变化(△A/min)，根据此值再准确地计算酶活性，可以利用全自动生化分析仪进行检测；酶和底物反应的特异性好，检测结果准确度高。

本发明主要采用辅酶指示系统的连续监测法进行检测。其检测原理为：LPS催化分解甘油三月桂酸酯，生成甘油和脂肪酸。在氧化型辅酶Ⅰ(NAD⁺)的参与下，甘油脱氢酶(GDH)将甘油上的氢转至还原型辅酶Ⅰ(NADH)，由于NADH在340nm处有特征吸收，所以NADH的上升速率和LPS的活力成正比。反应式如下：

本发明应用于脂肪酶检测试剂盒的制备，具有方法操作简单、结果准确度高、制成的试剂重复性好、线性范围宽的特点。

有益效果：本发明所涉及的一种脂肪酶检测试剂盒的制备方法，采用乙酸-醋酸镁缓冲液，不仅可以提高试剂的稳定性，且其中的Mg2+可作为LPS的激活剂而大大提高其准确度和灵敏度；同时加入展开剂，增强油水界面的表面张力，提高了试剂的反应度，增大了试剂可测线性范围。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。

附图说明

图1是采用本发明实施例1配制的试剂的线性结果图；