[发明专利]拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂、试剂盒、应用及检测方法

权利要求书

1.一种拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括拟除虫菊酯的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的一种拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂，其特征在于，所述拟除虫菊酯残留为枸杞中拟除虫菊酯类农药残留。

3.根据权利要求1所述的一种拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂，其特征在于，所述单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

用碳二亚胺法将间苯氧基苯甲酸和牛血清蛋白偶联合成免疫抗原；

用羰基二咪唑法将间苯氧基苯甲酸和鸡卵清蛋白偶联合成检测抗原；

用所述免疫抗原免疫小鼠，将其脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞；

用ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞；

用有限稀释法对所述杂交瘤细胞进行克隆并分离阳性杂交瘤细胞株，获得稳定分泌抗拟除虫菊酯的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

采用腹水诱导法，将含有所述杂交瘤细胞株的培养液注入小鼠腹腔产生腹水，所述腹水含有所述拟除虫菊酯的单克隆抗体。

4.一种拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：

96孔酶标板；

检测抗原PBA-OVA；

拟除虫菊酯单克隆抗体；

HRP标记的羊抗鼠酶标二抗；

间苯氧基苯甲酸标准品溶液；

碳酸盐缓冲液，0.1M，pH＝9.6；

洗涤液PBST，0.01M，pH＝7.4

底物TMB显色液，0.15mg/ml，3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；

反应终止液，2mol/L H₂SO₄。

5.权利要求1所述的检测试剂在制备拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂盒中的应用。

6.一种拟除虫菊酯残留的ELISA检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

用碳酸盐缓冲液将检测抗原稀释至1μg/ml，加入96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜；

向每孔中加入250μL洗涤液洗涤3-5次，弃洗涤液，拍干；

向96孔酶标板中加入枸杞样本50μl，拟除虫菊酯单克隆抗体50μl，加入空白对照，25℃反应30min；

向每孔中加入洗涤液洗涤3-5次，弃洗涤液，拍干；

向96孔酶标板每孔中加入用封闭液稀释1000倍的，HRP标记的羊抗鼠酶标二抗，每孔100μL，25℃避光反应30min；

向每孔中加入洗涤液并洗涤3-5次，弃洗涤液，拍干；

向96孔酶标板中加入酶底物TMB显色剂，每孔加入100μL，室温避光反应15min；

向96孔酶标板中加入终止液，每孔100μL，终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度OD值；

结果判断：用磷酸盐缓冲液将间苯氧基苯甲酸标准品分别稀释成浓度为0，125，250，500,1000及2000ppb的五个不同浓度后检测OD值；

以间苯氧基苯甲酸标准品质量浓度以10为底的对数为横坐标，以质量浓度分别为125、250、500、1000、2000ppb的间苯氧基苯甲酸标准品溶液的吸光度与质量浓度为0ppb的标准品溶液的吸光度比值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，将枸杞样品中测得的吸光度值代入标准曲线，计算得枸杞中间苯氧基苯甲酸残留量。