[发明专利]富集血浆或血清中12种中丰度和低丰度蛋白的方法

说明书

本发明公开了富集血浆或血清中12种中丰度和低丰度蛋白的方法，利用磷酸纤维素为柱料，色谱柱运行缓冲液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，洗脱液包含20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、1摩尔/升氯化钠和1毫摩尔/升乙二胺四乙酸，实现对12种中、低丰度蛋白的同时富集。采用高效液相色谱联合高分辨质谱对富集后样品进行检测，可鉴定这12种中丰度和低丰度蛋白，并进行定量分析。本发明方法的富集效果显著，方法简便，不需要使用昂贵的设备或耗材，成本低廉，便于推广和应用；不需要使用抗体，可以大大降低检测的费用，也可避免由于抗体质量稳定性问题带来的不确定性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及血浆或血清中的中、低丰度蛋白的富集方法。

背景技术

蛋白质组学能高通量地对蛋白质进行研究，可用于发现多种疾病诊断标志物和药物靶点。国际人类蛋白质组研究组织(Human Proteomic Organization,HUPO)早在2002年即启动了人类血浆蛋白质组计划(human plasma proteome project,HPPP)，其科学目标包括全面分析人类血浆和血清蛋白成分，确定不同人种血浆蛋白质的差异程度，以及确定不同生理和病理状态下的个体差异。然而，血浆蛋白质丰度差异巨大，血浆中21种主要高丰度及中等丰度的蛋白，如白蛋白、IgG、ɑ1抗胰蛋白酶、ɑ2巨球蛋白、转铁蛋白等占血浆总蛋白含量的99％以上，而其余的1％则由数千种低丰度甚至极低丰度的蛋白质组成。如白细胞介素6通常浓度范围在0～5ng/L，而白蛋白丰度为(35～50)×10⁹ng/L，高低丰度蛋白含量可差10¹²之巨，远远超出了二维电泳(two-dimensional electrophoresis,2DE)及其他蛋白质组学技术所能测定的范围。

人体组织器官发生病变时，来自病变组织或细胞的蛋白会进入到血液系统，这些蛋白质与机体的病理、生理状况密切相关，因此，对这些蛋白质进行检测和分析是发现与各种疾病相关生物标志物的最有价值样本之一，这些蛋白质包括不少低丰度蛋白，其蛋白浓度在ng/mL量级或更低。另一方面血液中蛋白的修饰情况也会影响蛋白的功能和稳定性，因而研究分析蛋白修饰的种类与水平能够反映机体的状态。由于修饰蛋白可能只占总蛋白的一小部分，因而即使是中等丰度的蛋白，对应修饰蛋白的实际浓度也比较低。本发明中我们关注以下12种中丰度和低丰度蛋白：

1.备解素(properdin,CFP):又称P因子，此蛋白正调节补体系统替代途径，可参与多个免疫反应，包括组织炎症和吞噬细胞对病原体的清除。备解素缺乏症是X染色体关联的遗传性的免疫系统疾病。

2.补体因子D(complement factor D,CFD):是在补体系统替代途径激活中起重要作用的丝氨酸蛋白酶。它也可能与代谢紊乱引起的肥胖相关。

3.凝血因子11(coagulation Factor XI,F11)：是一个在凝血通路中起作用的丝氨酸蛋白酶，与血友病丙、血管性血友病和血栓性静脉炎等相关。

4.乳铁蛋白(lactotranferrin,LTF):是铁传递蛋白家族中的一种多功能糖蛋白，主要存在于各种分泌液中。乳铁蛋白具有抗菌和抗病毒的功能，是先天免疫系统的重要成员，还能与DNA、RNA和多糖分子相互作用，参与许多重要生理过程。有研究认为乳铁蛋白是潜在的卵巢癌早期诊断的生物标志物。

5.髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO):是血红素过氧化物酶超家族成员之一，主要存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中。髓过氧化物酶的基因多态性与多种疾病的易感性有关，其表达水平的升高与患冠状动脉疾病易感性相关，还可以预测早期患心肌梗死的危险性。髓过氧化物酶与肺癌也存在相关性。