[发明专利]细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂

说明书

技术领域

本发明属于病毒疫苗技术领域，涉及一种细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂。

背景技术

麻疹是由麻疹病毒引起，经呼吸道传播的急性传染病，易感人群涵盖了所有无特异性免疫力及免疫力低下的儿童及成人。麻疹发病率及病死率在疫苗使用前位居儿童传染病之首。目前，疫苗接种仍旧是预防麻疹感染和控制其流行的最有效措施。

现阶段，国内外麻疹病毒的培养多使用原代鸡胚细胞转瓶培养技术，转瓶技术为传统的贴壁细胞培养技术，细胞接种在旋转的圆筒形培养器——转瓶中，培养过程中转瓶不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气。转瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，放大只需简单的增加转瓶数量等优点。但也有其缺点：

(1)自动化程度低，人工操作工作量大，虽然有转瓶机辅助，但各个工序操作环节中仍需要大量的手工操作，不能实现自动化和标准化；

(2)大量的清洗验证工作，清洗质量受人为因素的影响、难以保证清洗效果的一致性，人工和清洗验证成本逐年增加；

(3)占用空间大产，在现有的条件下，转瓶本身的局限性难以产业化或规模化生产；

(4)人工操作较繁琐，玻璃易碎，增加人员感染风险及操作环境的污染风险显著增加；

(5)生产工艺可控性差，瓶间差异较大，难以保证制品质量的细胞批间一致性，且细胞生长成单层成纤维细胞的时间较长，需要72-96h；

(6)病毒收获为单次收获，不能完整有效的利用细胞，影响产能的放大。

采用转瓶培养技术2-3次收获病毒原液，但每次收获的单次病毒原液仅为2000-3000mL，且瓶间病毒滴度差异较大，多次打开瓶口也会造成污染的风险升高。

目前，应用生物反应器进行大规模细胞培养亦称为国内外各个生产研究机构的关注重点，Vero细胞、人二倍体细胞应用生物反应器进行细胞培养已获得成功。但鸡胚、地鼠肾等原代细胞采用生物反应器进行培养还未有成功的报道。理论上讲，原代细胞培养利用生物反应器是可行的，但需进行长期的工艺摸索。

因此，获得高滴度麻疹病毒原液，配制多联多价的含麻疹病毒的系列疫苗，提高产品质量的均一性，扩大麻疹系列疫苗产品的产能，降低污染的风险，进一步复合日益升级的GMP管理的要求，充分满足国家免疫规划的要求是目前亟待解决的技术。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂，从而实现在同等生产规模下，减少细胞消化批数，并获得高滴度的麻疹病毒液，有效提高麻疹系列疫苗产品质量的均一性，扩大制品的产能。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现；

本发明提供一种利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法，其包括以下步骤：

选用SPF鸡胚细胞，加入细胞培养液制备成细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到细胞工厂中；

将麻疹病毒的工作种子与细胞悬浮液按照(0.005-0.05)：1的比例接种于细胞工厂中，于33±1℃的温度下静置培养3-4天，倾去原细胞培养液，换以新鲜的细胞培养液继续培养；

当细胞出现5％-10％的病变时，倾去细胞培养液，用不少于原细胞培养液量的洗液洗涤细胞表面，并换以病毒维持液继续培养；

当细胞出现50％-75％的病变时，收获单次麻疹病毒液。

单次麻疹病毒液即为单批次生产的麻疹病毒原液，将同一细胞批生产收获的单次麻疹病毒液澄清过滤并检测合格后进行合并。

上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述细胞培养液为灭能小牛血清的0.2％乳蛋白的Earle’s液。

上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，优选地，所述细胞悬浮液制备方法为：

选用9-11日龄来自SPF鸡群的鸡蛋，经消毒后取出鸡胚，去除鸡胚头部及内脏，剪碎；用0.125％的胰蛋白酶于37±1℃温度下对剪碎的鸡胚水浴消化18-22min，然后加入0.2％的乳蛋白Earle’s液进行分散处理，最后加入含灭能小牛血清的0.2％的乳蛋白Earle’s液作为细胞培养液，得到细胞悬浮液。

上述利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法中，当细胞出现50％-75％的病变时，收获单次麻疹病毒液的具体操作为：

当细胞出现50％病变时，进行第一次收获麻疹病毒液，收获后再加入新鲜的病毒维持液继续培养；