[发明专利]用于扩增底栖多毛类环节动物线粒体COI基因片段的引物

说明书

技术领域

本发明属于底栖多毛类环节动物领域，尤其涉及用于扩增底栖多毛类环节动物线粒体CO I基因片段的引物。

技术背景

多毛纲是环节动物门最大的一个纲，包括八十余科，一千六百多个属，一万多个已描述的种。多毛类动物大多生活在海洋生境中，是海洋中极为常见的动物类群，是鱼类及其他动物的重要饵料，是海洋资源调查的重要组成部分，也是海洋生物中尚待开发、利用、保护防除的潜在对象。

多毛类动物进行资源开发、利用、保护和防除工作，都需要对形态相似的物种进行确切的划分，仅以形态学为基础的分类鉴定显然已难以满足这些要求，因此建立一套基于物种的遗传信息的快速、高效、精确并且国际化的多毛类动物的分类标准，对提高海洋生物资源调查和海洋生态系统评估的效率和科学性，具有深远的意义。单多毛纲动物CO I基因序列A+T含量较高，A+T含量高一方面使得多毛类 CO I基因序列PCR扩增时必须要使用较其他物种更低的退火温度，另一方面大量重复的A、T核苷酸，往往导致引物很难结合到基因序列上，从而使扩增反应终止，增加了该物种CO I基因片段扩增的难度。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述问题，用于扩增底栖多毛类环节动物线粒体CO I基因片段的引物，经验证适用于扩增A+T含量较高的多毛类物种。

本发明采用的技术方案为：

用于扩增底栖多毛类环节动物线粒体CO I基因片段的引物，其特征在于，由一对引物组成：

正向引物：5′-TCCACTAATCAYAAAGAYATTGG-3′ SEQ ID NO.1；

反向引物：5′-GCGAGTCATCTAAATACTTTAAT-3′ SEQ ID NO.2。

所有引物均由上海生工生物有限公司合成。

一种底栖多毛类环节动物线粒体CO I基因片段的扩增方法，采用上述引物，用25mlPCR体系在PCR扩增条件下进行目标片段扩增。

进一步地，所述的25ml PCR体系是：TaqMix 12.5ml，模板 DNA1ml，正向引物1ml，反向引物1ml，灭菌的双蒸水9.5ml。

进一步地，所述的PCR扩增条件是：94℃预变性4min；94℃变性45s，46℃退火30s，72℃延伸1min，扩增36个循环，之后 72℃延伸7min。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

一、引物是针对多毛纲一些类群的特异性引物，可扩增出约 900bp的CO I基因片段，较通用引物更长，效果优于通用引物。

二、引物扩增效果稳定，对于高A+T含量的多毛类物种CO I基因序列，与通用引物相比本发明引物跨过了A、T核苷酸大量重复的区域，特别是反向引物与通用引物相比，不但与正向引物相距更远，而且几乎完全位于多毛类Co I基因的保守区上，因此，对于高A+T 含量的多毛类物种用本发明设计的这对引物可以扩增片段更长，浓度更高的CO I基因序列片段，具有明显的应用优势。

附图说明

图1PCR扩增CO I基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

实施例1

1.样品DNA提取和储存

底栖多毛类环节动物DNA全基因组提取采用高盐法提DNA (Salah M.Aljanab et al，1997)，将DNA样本于烘箱中56℃烘干后，加入60ml灭菌的双蒸水，放入-20℃冰箱中10小时以上或者65 ℃水浴1小时，使得DNA充分溶解；经Thermo公司的Nanodrop 2000/2000C分光光度计检测DNA产品的OD260nm、OD280nm值，以及浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳(160V、80A)检测DNA产品的质量，选取浓度和纯度浓度在10-100ng/ml，未降解的DNA样本保存于-20℃冰箱中，备用。

2.PCR扩增CO I基因

正向引物：5′-TCCACTAATCAYAAAGAYATTGG-3′ SEQ ID NO.1；

反向引物：5′-GCGAGTCATCTAAATACTTTAAT-3′ SEQ ID NO.2。