[发明专利]一种利用短单链DNA抑制昆虫基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种利用短单链DNA抑制昆虫基因表达的方法，依次包括下述步骤：1）确定昆虫靶标基因，PCR扩增获得其DNA序列并测序；2）根据步骤1）得到的DNA序列设计短单链DNA片段；3）将步骤2）得到的短单链DNA片段稀释后利用微量注射的方法注射入昆虫体内；4）对步骤3）的昆虫的靶标基因的表达进行RT‑qPCR的检测，确定其靶标基因的相对表达水平。

技术领域

本发明涉及一种利用短单链DNA抑制昆虫基因表达的方法，属于生物技术领域。

背景技术

同源依赖性基因沉默被广泛应用于分子生物学的研究，主要通过降低转录产物而减少蛋白的合成，从而使其丧失原有的功能。目前用于调控基因表达的同源片段大多数为反义RNA与双链RNA；随着研究的发现，DNA片段的导入也可引起基因的沉默，被称为DNA干扰（DNA interference）。

研究指出，将NgAgo蛋白引入了斑马鱼中，发现注射内源基因的DNA片段后，靶标基因的表达会受到抑制，但并不会引起基因突变（Qi J, Dong Z, Shi Y, et al. NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish[J]. Cell research, 2016, 26(12): 1349-1352）；同样的，将原核生物中也存在这一现象（Swarts D C, Jore M M, Westra E R et al. DNA-guided DNA interference by aprokaryotic Argonaute. Nature, 2014,507(7491):258），向导DNA即可以互补靶标RNA而后切割靶标RNA（Sunghyeok Y, Taegeun B, Kyoungmi K et al. DNA-dependent RNAcleavage by the Natronobacterium gregoryi Argonaute. bioRxiv, 2017, doi:10.11101/101923），也可以互补靶标DNA而切割靶标DNA(Swarts D C, Hegge J W, HinojoI et al. Argonaute of the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guidednuclease that targets cognate DNA. Nucleic Acids Research, 2015, 43(10):5120-5129)。

目前，虽然已在部分生物体内发现短单链DNA抑制基因表达现象，但是在昆虫中至今还未有报道。因此，我们结合这一现象设计了以下的试验，以求通过短单DNA来达到抑制小菜蛾基因的表达。

发明内容

针对上述问题，本发明公开了一种通过注射短单链DNA来抑制昆虫基因表达的方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用短单链DNA抑制昆虫基因表达的方法，依次包括下述步骤：

1）确定昆虫的靶标基因，PCR扩增获得其DNA序列并测序；

2）根据步骤1）得到的DNA序列，设计短的单链DNA片段，送与公司合成；

3）将步骤2）得到的单链DNA片段稀释后，利用微量注射的方法注射入昆虫体内；

4）对步骤3）的昆虫进行RT-qPCR的检测，确定其靶标基因的相对表达水平。

步骤1）所述的注射的靶标基因为小菜蛾鞣化激素α亚基基因（该基因mRNA的GenBank：KJ783481）或精氨酸激酶基因（该基因mRNA的GenBank：HQ327310）。