[发明专利]一种重组融合蛋白V12‑CD137L的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是用于重组蛋白促进淋巴细胞体外培养的一种重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法及应用。

背景技术

CD137L蛋白属肿瘤坏死因子超家族成员(TNFSF9)，其一级结构有254个氨基酸残基,其中0-25位氨基酸残基为胞质区,26-48位氨基酸残基为连接段,是疏水区域，可形成跨膜区,其余部分为胞外段的功能区，CD137L主要表达于活化的T细胞和B细胞，为淋巴细胞协同刺激因子，与其受体4-1BB结合，可启动双向信号转导：正向信号可刺激T细胞活化和增殖；反向信号可刺激B细胞增殖。因此，CD137L可以有效促进淋巴细胞的活化、增殖、分化，进而增强体内淋巴细胞免疫应答。许多研究表明，CD137L可以作为肿瘤相关抗原（TAA）的免疫增强剂。

为了大量获得CD137L，重组蛋白表达系统（原核/真核）是一种有效、可行的技术手段。但是，天然的4-1BBL蛋白在体内以三聚体的形式存在，呈三叶螺旋桨结构，而通过表达系统表达获得的蛋白，受蛋白结构以及与细胞表面分子的亲和力等因素的影响，往往使得表达的CD137L蛋白生物活性较低、甚至不具有生物活性，从而给CD137L蛋白的人工制备带来了极大的挑战。因此，研究一种有效方法来提高CD137L的生物学功能，具有极大的医学意义和应用价值。通过改造CD137L蛋白结构，提高其与淋巴细胞的亲和力，有可能提高CD137L体外表达重组蛋白的生物活性。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程技术人工设计一种重组融合蛋白V12-CD137L，并提供其制备方法及应用。该重组蛋白可以有效提高淋巴细胞在体外的增殖，分化水平，同时还可以增强机体的细胞免疫水平，并通过大肠杆菌表达，提高制备效率，有利于工业化生产。

本发明是将艾滋病病毒gp120蛋白中的与淋巴细胞具有亲和功能的V1V2区与CD137L的功能区结合，形成一种新的重组融合蛋白,命名为V12-CD137L，V12-CD137L蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其中第1-76位为艾滋病病毒 gp120中的V1V2区，第77-283位为CD137L的功能区。V12-CD137L重组融合蛋白可以将CD137L蛋白的功能区靶向定位到淋巴细胞上，有效提高CD137L的生物活性，促进淋巴细胞的体外增殖，增强细胞免疫水平。

本发明为人工设计一种重组融合蛋白V12-CD137L，该蛋白由艾滋病病毒gp120中的V1V2区与CD137L的功能区结合而成，兼具靶向定位淋巴细胞的功能和CD137L蛋白功能。V12-CD137L通过大肠杆菌表达，层析柱分离、纯化，最终得到高纯度、高活性的重组蛋白。该重组蛋白促进淋巴细胞在体外培养的增殖水平，且效果优于单纯的CD137L重组蛋白，同时该重组融合蛋白还能增强体内的细胞免疫水平。

本发明所述重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法为：以SEQ ID NO.1所述氨基酸序列为模板，设计经过密码子优化的能够表达V12-CD137L蛋白的基因序列并在基因的5’端引入组氨酸标签序列，最终得到表达基因SEQ ID NO.2，所得SEQ ID NO.2基因序列插入表达系统中，通过表达得到重组的V12-CD137L融合蛋白。

本发明涉及一种重组融合蛋白V12-CD137L的制备方法及应用，所述重组融合蛋白V12-CD137L是由艾滋病病毒gp120蛋白中的与淋巴细胞具有亲和功能的V1V2区与CD137L的功能区结合而成，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，表达重组融合蛋白V12-CD137L的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；SEQ ID NO.2基因序列通过以下步骤得到V12-CD137L重组融合蛋白；

本发明所述重组融合蛋白V12-CD137L具体步骤如下：

(1) 人工合成SEQ ID NO.2基因，将融合基因插入大肠杆菌表达系统，获得表达V12-CD137L重组蛋白的重组大肠杆菌；

(2) 将步骤(1)所得重组大肠杆菌进行37℃培养，20-25℃诱导其表达重组蛋白V12-CD137L，获得诱导后的重组大肠杆菌；

(3) 将步骤(2)所得诱导后的重组大肠杆菌进行细胞破碎，通过离心获得重组大肠杆菌破碎上清液；

(4) 将步骤(3)所得重组大肠杆菌破碎上清液通过层析柱进行分离纯化，得到V12-CD137L重组蛋白纯化液；

(5) 将步骤(4)所得V12-CD137L重组蛋白纯化液置于透析袋中，用透析液进行透析，获得稳定的V12-CD137L重组蛋白。