[发明专利]一种的微生物菌株及其选育方法和应用

说明书

本发明提供了一种用于微生物菌株及其选育方法和应用，包括：以分枝杆菌菌株CCTCCNO:M2012522为出发菌株，将菌株经固体活化培养基在斜面或平板培养活化，然后将活化的菌株通过液体培养基制备成菌体浓度为10⁷～10⁸个/mL的第一菌悬液；将第一菌悬液进行紫外‑LiCl复合诱变，分离后培养，挑取单菌落进行活化和发酵；以紫外‑LiCl复合诱变筛选出的菌株制备第二菌悬液，菌体浓度为10⁷～10⁸个/mL，进行亚硝基胍诱变，分离后培养，挑取单菌落进行活化和发酵，筛选后得到双降醇生产菌株。然后对双降醇提取工艺进行优化，获得高纯度的精制产品。与现有技术相比，本发明得到了遗传性状稳定的双降醇生产菌株，优化提取技术，为进一步工业化生产奠定了良好的基础。

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种用于制备双降醇的微生物菌株及其选育方法和应用。

背景技术

甾体药物是品种多和应用广泛的一大类药物，临床上需求量仅次于抗生素，主要用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等疾病。我国在甾体药物研究开发与世界先进国家相比还有一定的差距，主要表现为甾体药物合成步骤多，反应复杂，基团的远程效应十分明显，收率低，特别是分离纯化困难。图1为植物甾醇转化双降醇的途径及关键酶系。

双降醇(21-hydroxy-20-methylpregn-4-en-3-one)分子式为C₂₂H₃₄O₂，分子量为330.5，是甾体激素类药物的一种重要中间体，可以用作甾体药物黄体酮和氢化可的松的合成，具有重要的商业价值。微生物降解植物甾醇的的工作开始于20世纪60年代，目前已经发现许多微生物可以降解植物甾醇，包括Arthrobacter，Brevibacterium，Pseudomonas，Nocardia，BaciI/us，Streptomyces，Microbacterium，Achromobacter，Protaminobacter，Comamonas，Mycobacterium；fIJRhodococcus等菌种，微生物通过体内酶系高效降解植物甾醇侧链以及氧化母核环。研究表明，9-羟化酶KshA与KshB共同催化形成9-羟基雄烯二酮，从而进一步催化最终降解为二氧化碳和水。研究表明，C₂₂脱氢酶是植物甾醇生成4-雄烯二酮与双降醇的关键酶系，脱氢活力较高时主要向4-雄烯二酮转化，而相对较弱时主要向双降醇途径转化。此外也有研究表明，3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(3-ketosteroiddelta1-dehydrogenase)可以促使4-雄烯二酮与双降醇分别转化为1，4-雄烯二酮与1，4-双降醇。湖北共同生物科技有限公司通过诱变方法(专利号CN103382445A)成功获得9-羟化酶缺陷菌株，保藏在武汉大学中国典型微生物保藏中心，编号为CCTCCNO:M2012522。本发明在前期的诱变株基础之上进一步采用紫外线-LiCl以及亚硝基胍复合诱变方法得到C_1，2脱氢酶以及C₂₂脱氢酶双重缺陷菌株，从而富集转化生产双降醇。

发明内容

本发明的目在于提供一种用于制备双降醇的微生物菌株及其选育方法和应用，得到遗传性状稳定的双降醇生产菌株，同时优化提取工艺，获得高纯度的双降醇精制产品。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种微生物菌株，为分枝杆菌属分支杆菌种，拉丁文为Mycobacterium sp.HBCBA-1，保藏单位为中国典型菌种保藏中心，保藏地址中国武汉大学，保藏日期为2017年6月19日，保藏号为CCTCCNO：M2017349，主要特征为细胞为杆状，革兰氏染色为阳性G+，过氧化氢酶阳性，V.P.反应、甲基红试验以及吲哚试验均为阴性。

一种上述菌株的选育方法，包括以下步骤：