[发明专利]一种高效创建国兰有性多倍体的方法

权利要求书

1.一种高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 亲本选择和杂交组合配置：选择高效发生2n配子的杂交兰或国兰做亲本，配置杂交组合，获得果实；

S2. 种子培养和中间繁殖体鉴定：对兰花种子进行无菌培养获得中间繁殖体，将单粒种子形成的中间繁殖体进行继代增殖培养，观察中间繁殖体形态、生长速度，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体；

S3. 植株再生和试管苗形态观察：对选到的中间繁殖体进行分化培养和生根壮苗培养，对形成的再生植株进行形态学观察，选择国兰株型、植株粗壮、叶色深、叶厚、根粗壮、根尖端圆钝的植株；

S4. 细胞学鉴定和有性多倍体的获得：对当选的植株进行测定，染色体数为60条或以上的为多倍体。

2.根据权利要求1所述高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，步骤S1亲本选择中母本为小香，父本为兔耳兰。

3.根据权利要求1所述高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，所述步骤S2包括以下步骤：

S21. 果实消毒、接种和初代培养：将杂交后150-270天的果实洗净，然后用75%乙醇消毒8~10分钟，无菌水冲洗3~5次，取其内部种子接种到固体培养基上培养；培养条件为温度26℃，暗培养；

S22. 中间繁殖体的增殖：将种子萌发后形成的中间繁殖体分开，将单个中间繁殖体或将其切成长度2~8 mm小段，分别接种于继代培养基上培养；培养条件为温度26℃，每日光照8~12小时，光照强度500~1000lux；

S23. 中间繁殖体形态观察：对中间繁殖体的繁殖速度、形态特征进行观察，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体。

4.根据权利要求3所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，S21所述固体培养基配方为：1/2MS培养基+0.2～0.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+10～20%（v/v）椰子汁+30g/L糖+0.3～2g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。

5.根据权利要求3所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，所述的步骤S22中增殖培养基配方为1/2MS培养基+0.5～2 mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+0.2～0.5g/L 活性碳+30g/L糖+7.5g/L卡拉胶。

6.根据权利要求1所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，S3所述植株再生和试管苗形态观察包括如下步骤：

S31. 芽分化培养：将继代培养的中间繁殖体分开，接种于芽分化培养基上培养，培养条件为温度26℃，每日光照10小时，光照强度1000~2000lux；

S32. 生根壮苗培养：将高2~4cm从中间繁殖体上切下，接种到生根壮苗培养基上培养，培养条件为温度26℃，每日光照10小时，光照强度1000~2000lux；

S33. 试管苗观察：对试管苗及其形成过程进行观察，生长慢、形成过程时间长，粗壮、叶片厚，叶色深、根短粗壮、根尖部圆钝的试管苗为拟似多倍体，以形态正常的植株做对照。

7.根据权利要求6所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，S31所述的芽分化培养基配方为：1/2MS培养基+1.5～2.0mg/L 6-BA+0.1～1mg/L NAA+30g/L糖+0～0.3g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。

8.根据权利要求6所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，步骤S32中生根壮苗培养基配方为：1/2MS培养基+0.1～0.2mg/L 6-BA+0.5～2mg/L NAA+20～40g/L糖+0.2～0.5g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶。

9.根据权利要求1所述的高效创建国兰有性多倍体的方法，其特征在于，S4包括以下步骤：

S41. 流式细胞仪鉴定：以试管苗叶片为材料，根尖细胞染色体为40的二倍体为对照，采用Partec-cyview85流式细胞仪确定当选拟似多倍体植株的倍性；

S42. 根尖细胞染色体鉴定：以幼嫩根尖为材料，采用压片法鉴定当选试管苗根尖细胞染色体数，染色体数为40时为二倍体，染色体为60或以上时为多倍体；

S43. 有性多倍体的获得：将确定为多倍体的试管苗进行移栽和栽培，即可获得有性多倍体。