[发明专利]基于双链探针的液相杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基因组测序文库杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒以及它们在液相杂交捕获中的应用。所述捕获试剂盒包括2×浓度溶液以及100％去离子甲酰胺，其中，所述2×浓度溶液包含100‑150mM的磷酸二氢钠、4×柠檬酸钠缓冲液、1‑3mM的乙二胺四乙酸、2×Denhardt溶液、2‑5mg/ml的Carrier RNA及15‑20w/w％的硫酸葡聚糖，其中，所述4×柠檬酸钠溶液包含0.6M氯化钠、0.06M柠檬酸钠，pH7.0；并且所述2×Denhardt溶液包含0.04％聚蔗糖400、0.04％聚乙烯吡咯烷酮以及0.04％牛血清蛋白。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及基因组测序文库杂交捕获试剂盒、洗涤试剂盒以及它们在液相杂交捕获中的应用。

背景技术

20世纪初诞生了新一代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)，这一技术的出现为DNA测序技术领域带来了突飞猛进的进展。与一代测序技术相比，二代测序技术具有高通量、高准确性的技术特点，可对数以亿计的DNA片段同时进行测序。与传统的Sanger法测序相比NGS测序成本大大降低。但全基因组测序成本仍然较高，且许多研究应用并不需要全基因组测序，而对于一个或多个样本的目标区域测序的需求较为迫切，因此对目标区域有针对性地测序方法能够显著地降低测序成本，同时也能缩短测序时间和生物信息分析周期。目标序列捕获技术的出现，满足了上述需求。目标序列捕获测序是针对已知的特定基因组区域设计探针捕获后进行测序，在靶向富集过程中不感兴趣的DNA片段会被最大限度的去除，使得测序所产生的结果主要集中于感兴趣的目标区域。目前常用的序列捕获方法有：PCR法、分子倒置探针法(MolecuLar insersion probe，MIP)和杂交捕获法。PCR法具有高灵敏性、高特异性和重复性好等优点，不过这种方法并不能很容易扩大目标区域，适合捕获一些很小的区域，且部分区域扩增困难，针对突变频率较低的体细胞突变检测灵敏度不够等问题没有很好的解决办法。分子倒置探针法具有样品前期处理简单、样品需求量小等优点，然而其分子探针合成成本较高，均一性较差，难以对一些区域较大的基因组序列进行捕获。杂交捕获法通过目标DNA片段和已带有生物素标记探针特异性杂交方式将目标序列捕获和分离出来。这一技术在二代测序平台中应用较为广泛，尤其是液相杂交捕获方法在目标区域捕获技术领域有着独有的优势。液相杂交捕获技术可以克服上述PCR法和分子倒置探针法的问题，具有更好的捕获效率，更少的偏好性，更高的检测灵敏度，更简便的操作和适合的成本等优点。

液相杂交捕获技术中高效的捕获效率及高准确性主要取决于三个方面：1.探针的准确性及特异性；2.杂交缓冲液环境及杂交条件；3.杂交后的洗涤缓冲液环境及洗涤条件。高准确度及高特异性的生物亲和素标记探针是高杂交准确性的保证，本领域现有的探针合成技术已能够达到该水平，如IDT公司的探针合成技术。而找到一种高效的杂交缓冲液、杂交条件及洗涤缓冲液及洗涤方法显得尤为重要，这一环节是有效提高杂交效率，提高捕获准确性，简化实验流程及降低成本的主要瓶颈及限速步骤。

因此，基于以上研究成果及技术特点，开发一种高效的、准确度高的、低成本的液相杂交捕获试剂及方法较为迫切，以满足对靶向测序日益增长的要求。

发明内容

本发明涉及用于双链核酸杂交及洗涤的新型组合物、相关试剂盒以及杂交洗涤方法。这些组合物和方法与传统过程相比，能够更快、更高效、捕获效果更好地完成基因组DNA的靶标区域富集。

本发明的一个方面在于提供一种基因组测序文库杂交捕获试剂盒，其包括2×浓度溶液以及100％去离子甲酰胺，

其中，所述2×浓度溶液包含100-150mM的磷酸二氢钠、4×柠檬酸钠缓冲液、1-3mM的乙二胺四乙酸、2×Denhardt溶液、2-5mg/ml的Carrier RNA及15-20w/w％的硫酸葡聚糖，

其中，所述4×柠檬酸钠溶液包含0.6M氯化钠、0.06M柠檬酸钠，pH7.0；并且