[发明专利]一种用于富集副溶血性弧菌的免疫磁珠制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫磁珠的制备方法，该制备方法用于分离致病性微生物副溶血性弧菌，包括副溶血性弧菌免疫磁珠的制备方法和应用方法。

背景技术

免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic bead-based separation,IMS)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠(Immunomagnetic bead,IMB)既可结合活性蛋白质抗体，又可被磁铁吸引，经过处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原一抗体一磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力作用下，发生力学移动，使复合物与其它物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。IMS是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌等方面取得了显著成绩。近年来IMS以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等标本中病原微生物的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。

目前，副溶血性弧菌免疫磁珠的制备有初步的研究，一方面利用国外进口磁珠为基础，成本较高；另一方面以国内磁珠为基础制备的免疫磁珠灵敏度较差。本专利在这些研究的基础上改进了免疫磁珠的制备工艺，从而提高了副溶血性弧菌免疫磁珠的灵敏性，同时凭借其免疫磁珠自身的快速方便、不需要大型检测仪器、价格低廉的特点可以运用于食品，饲料、医疗环境和自然环境中副溶血性弧菌的分离与富集，为高效快速检测副溶血性弧菌提供了可能。

发明内容

本发明提供了一种用于富集副溶血性弧菌的免疫磁珠制备方法及应用，可广泛应用于食品、农业用品、化妆品、养殖环境和临床中等领域的副溶血性弧菌分离与检测。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于富集副溶血性弧菌的免疫磁珠的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤一：活化磁珠，采用活化剂EDC与磁珠在活化缓冲溶液中进行活化反应，室温条件下活化90min，活化磁珠上带有的羧基基团可以提高磁珠与抗体蛋白的结合能力；

步骤二：磁珠与抗体偶联，采用活化后的磁珠与副溶血性弧菌抗体在偶联缓冲液中偶联，室温条件下振荡26h，制备副溶血性弧菌免疫磁珠；

步骤三：封闭免疫磁珠，免疫磁珠经洗涤缓冲液洗涤，采用封阻缓冲液封闭免疫磁珠，37℃作用1～2h或4℃过夜；

步骤四：保存，制备好的副溶血性弧菌免疫磁珠存放于保存缓冲液中，4℃保存待用。

进一步的，

所述活化剂EDC：1mg/mL；

所述活化缓冲溶液：0.1M MES含0.05％吐温-20，pH6.0-6.5；

所述偶联缓冲液：0.1M PBS含0.05％吐温-20，pH7.0-7.4；

所述洗涤缓冲液：0.1M PBS，0.1％BSA，0.05％吐温-20；

所述封阻缓冲液：0.1M PBS，含1％BSA和0.05％吐温-20，pH7.0-7.4；

所述保存缓冲液：0.1M MES，pH7.4。

一种用于富集副溶血性弧菌的免疫磁珠的应用方法，使用如上述的副溶血性弧菌免疫磁珠，所述方法包括以下步骤：

步骤I：根据国标方法GB 4789.7对样品进行制备，将1mL副溶血弧菌免疫磁珠加入到制备好的样品中，37℃振荡孵育1h后至磁分离器，去上清；

步骤II：洗涤免疫磁珠后加入0.3mL偶联缓冲液，分别吸取0.1mL混合液涂布3个弧菌显色培养基，37℃培养18h-24h计数。

进一步的，制备副溶血性弧菌免疫磁珠分离与检测食品、农业用品、化妆品、养殖环境和临床中等领域的副溶血性弧菌。

本发明的有益效果在于：