[发明专利]一种肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法

说明书

本发明提供了一种肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法。本方法通过EGFP标记促凋亡蛋白质，并通过流式细胞术测量肿瘤细胞所能耐受促凋亡蛋白质分子时的EGFP数值，通过FITC标记的荧光微球以及FITC与EGFP的激发荧光强度的换算，实现肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目的绝对定量的测量。本发明方法不仅解决了传统研究中蛋白质含量增加多少倍引起细胞凋亡而缺少绝对数值的问题，也避免了利用BH3分析方法中遇到的BH3小肽的活性问题以及BH3小肽与BH3蛋白质之间的区别问题，实现了肿瘤活细胞耐受促凋亡蛋白质分子的绝对定量测试。

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法。

背景技术

肿瘤严重危害人类健康。近年来大量研究表明肿瘤的发生，发展和治疗都与细胞凋亡有着紧密的联系。细胞凋亡信号通路主要包括死亡受体通路和线粒体通路。死亡受体通路中当死亡受体（例如DR4,DR5等）与其配基结合（例如TRAIL）后，就可以促进细胞凋亡，所以这些死亡受体都是促凋亡蛋白质。线粒体细胞凋亡途径主要是由BCL2家族控制的。BCL2蛋白质家族成员分为抗凋亡蛋白质和促凋亡蛋白质，促凋亡蛋白质又包括仅含BH3结构域的促凋亡蛋白（BIM、PUMA、NOXA、BMF、BAD、HRK等）和多结构域促凋亡蛋白BAX和BAK。BCL2家族通过蛋白质相互作用调控线粒体膜的通透性，控制线粒体内细胞色素c等一系列促凋亡蛋白质的释放，激活caspase，从而引起一系列细胞凋亡反应。其它的细胞内很多蛋白质也是促凋亡蛋白质（例如P53，ERK），它们通过促进下游的促凋亡蛋白质的转录表达或者提高下游促凋亡蛋白质在细胞内的稳定性等方式来促进细胞凋亡。

细胞凋亡对于肿瘤研究至关重要。一方面，抗凋亡BCL2家族蛋白质在多种肿瘤中高表达。另一方面，很多抗肿瘤药物，包括DNA损伤类药物、激酶抑制剂和微管聚集抑制剂等，也是通过诱导线粒体细胞凋亡途径来杀死肿瘤细胞的。不仅如此，很多促凋亡蛋白质的类似物已经成为抗肿瘤药物或正在进行临床试验。例如，促凋亡蛋白质BAD的BH3的类似物navitoclax，能特异性抑制BCL2, BCLx_L和BCLw，从而引起肿瘤细胞凋亡，目前正在多种肿瘤进行临床试验。而更特异性的BCL2抑制剂venetoclax已经被批准用于复发性慢性淋巴细胞性白血病的治疗。所以，测量肿瘤细胞凋亡耐受促凋亡蛋白质的绝对分子数目不仅有助于我们预测抗肿瘤药物对某种特定肿瘤的治疗疗效，也有助于我们判断哪些蛋白质分子是有效的药物靶分子。

比较早期的研究方法通常是通过免疫印迹的方法来发现哪些促凋亡蛋白质在细胞内表达增加，然后通过过表达的方法来验证这些蛋白质确实具有促凋亡作用，并不能实现定量分析（Puthalakath H,等. Cell death and differential,2002, 9 (5):505-512；Li R,等. Cell death and differential, 2005, 12 (3): 292-303）。近年来陆续发展的BH3分析的方法（Deng J, 等. Cancer Cell, 2007, 12: 171-185； Vo TT, 等. Cell,2012, 151: 344-355），然而，该方法有着其局限性：(1)BH3蛋白质相应的BH3小肽并不能完全反应BH3蛋白质，研究显示BH3小肽的活性与仅含BH3蛋白质之间的活性是有区别的（DaiH,等.The Journal of Biological Chemistry, 2014,289:89-99）；(2)因为该方法是使用分离的线粒体完成的，所以利用BH3小肽检测的方法只适用于线粒体细胞凋亡途径，而不能在其它的促凋亡蛋白质上加以运用。

发明内容

本发明提供一种肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目绝对定量的测量方法。通过EGFP标记促凋亡蛋白质，并通过流式细胞术测量肿瘤细胞所能耐受促凋亡蛋白质分子时的EGFP数值，通过FITC标记的荧光微球以及FITC与EGFP的激发荧光强度的换算，实现肿瘤细胞耐受促凋亡蛋白质分子数目的绝对定量的测量。

本发明采用的技术方案如下：