[发明专利]一种基于体液中细胞源性囊泡的多功能载体及制备方法和应用有效
| 申请号： | 201710556332.1 | 申请日： | 2017-07-10 |
| 公开（公告）号： | CN107375234B | 公开（公告）日： | 2021-03-05 |
| 发明（设计）人： | 陈刚;张伟;庞代文;夏厚福;任建岗;余自力;杨解纲;赵怡芳 | 申请（专利权）人： | 武汉大学 |
| 主分类号： | A61K9/50 | 分类号： | A61K9/50;A61K31/704;A61K45/00;A61K47/46;A61K48/00;A61K49/00;A61P35/00 |
| 代理公司： | 武汉宇晨专利事务所 42001 | 代理人： | 王敏锋 |
| 地址： | 430072 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 体液 细胞 源性囊泡 多功能 载体 制备 方法 应用 | ||
1.一种基于体液中细胞源性囊泡的多功能载体的制备方法，其步骤是：
(1)收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，再次在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，获取上清，然后在3-5℃条件下继续48000～52000g离心60min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性微粒；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，然后在3-5℃条件下继续12000～16500g离心20～40min，取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～120000g离心60～70min将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性外泌体；收集5mL循环血或唾液，将其转移至离心管中，在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，取上清，再次在3-5℃条件下用1800～2200g离心18-22min，获取上清，然后在3-5℃条件下继续100000～120000g离心60～70min，将获取的沉淀用无菌PBS重悬，重悬后液体冻存于-80℃，获得体液中细胞源性膜性囊泡，所述的细胞源性膜性囊泡包括体液源性微粒和体液源性外泌体；
(2)将20μg体液中细胞源性膜性囊泡、50μL超小粒径发光材料和150μL电穿孔缓冲液加入到电击杯中并混匀，设置电穿孔参数：输出脉冲电压250V，电容250μF，单次脉冲，将电击杯置于电穿孔仪上，按上述参数进行电穿孔，电穿孔结束后，将混合液室温放置28-32min，最后，将混合液在3-5℃条件下18000g～22000g离心18-22min，弃上清，用150μL PBS重悬沉淀，获取超小粒径发光材料标记的体液来源细胞源性膜性囊泡；
所述的超小粒径发光材料为直径1.8nm的超小锰磁性近红外量子点，浓度为1mg/mL；
(3)将步骤(2)中获得的基于体液来源细胞源性膜性囊泡并经超小粒径发光材料标记的多功能载体、肿瘤化疗药物或siRNA、miRNA用于基因治疗的核酸片段，以及电穿孔缓冲液混合，经电穿孔方式向该多功能载体内载入肿瘤治疗药物或基因治疗片段，反应参数同步骤(2)，电穿孔结束后，将混合液室温放置28-32min，最后，将混合液在3-5℃条件下18000g～22000g离心18-22min，弃上清，用150μLPBS重悬沉淀，获取超小粒径发光材料标记，载有化疗药物或治疗基因的体液来源细胞源性膜性囊泡。
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