[发明专利]再内皮化胰腺脱细胞支架及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种再内皮化胰腺脱细胞支架的制备方法。

背景技术

目前全球糖尿病患者数量庞大，给个人身心健康和社会经济带来了巨大负担。胰岛或胰腺移植作为胰岛素依懒型糖尿病较理想的治疗方法，是目前再生医学研究领域的热点，然而供体组织来源短缺远不能满足庞大的患者群体的临床需求。胰腺脱细胞支架具有仿真三维超微结构，且较大程度的保留原有ECM成分和活性因子，为再种植细胞功能发挥提供了理想微环境，是构建工程化胰腺组织理想的供体支架来源。目前已有构建的工程化胰腺组织并不能长期持续发挥血糖调控功能，宿主血糖水平在移植后期呈缓慢升高趋势。缺乏充足氧气和营养物质供给的有效血管网络的形成是构建理想的可移植人工组织的主要限制因素，通过局部微血管网络的形成可以显著改善移植后局部缺氧导致的细胞凋亡。未进行血管化构建的组织或器官，植入体内后的存活须依赖宿主血管的长入，然而宿主血管长入的速度大都难以满足具有一定体积的移植体的需求，特别是在植入的早期阶段。且支架材料与血液接触后将启动机体的凝血机制，使其周围形成血栓从而进一步加剧植入工程化组织氧和营养供应障碍。

目前通过三维动态循环灌注再种植胰岛素分泌细胞所构建的组织工程胰腺支架在体内移植后具有一定程度血糖调控作用。然而支架植入机体后，血管新生需要数天时间，细胞耐受缺氧限于数小时；细胞存活需要的氧和营养仅能靠机体组织液渗透供应，距离有限，效果难以保证；另一方面，组织损伤创面或手术切口会启动机体凝血系统产生保护反应，被血凝块包围的支架移植物及内部营养物质和氧的运送极其有限。因此通过胰腺脱细胞支架再血管化形成完善的血液循环系统，为再种植细胞提供充足的营养和氧气供给，可以保证再种植细胞生长所需微环境的稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗凝效果在局部发挥且可控，有利于捕获内皮祖细胞促进支架再内皮化的再内皮化胰腺脱细胞支架及其制备方法。

本发明的技术解决方案是：

一种再内皮化胰腺脱细胞支架，其特征是：所述再内皮化胰腺脱细胞支架为在脱细胞的胰腺脱细胞支架的脉管中组装有具有抗凝作用的硫酸多聚糖。

所述硫酸多聚糖为肝素或硫酸软骨素。

所述胰腺脱细胞支架来源为小鼠、大鼠或猪胰腺。

一种再内皮化胰腺脱细胞支架的制备方法，其特征是：包括下列步骤：

1）取50 mL MES缓冲液，加入100 mg 肝素、100 mg EDC和60 mg NHS，37℃预反应10 min，活化羧基；

2）将所配置上述溶液运用三维灌注培养法经脾动脉于37℃、0.5-2 mL/min循环灌注2-8 h，负载肝素于胰腺脱细胞支架脉管中；

3）依次经0.1 mol/L Na₂HPO₄灌注2 -4 h，去离子水灌注2-8 h，得到负载结合有肝素的胰腺脱细胞支架；

4）钴-60辐照灭菌，将4×10⁷个内皮祖细胞，加入1 ml培养基，充分混匀，经脾动脉注射，静置6 h，1 ml/min循环灌注3 d，获得再内皮化胰腺脱细胞支架。

步骤1）中MES缓冲液 浓度为0.05 mol/L，pH为5.6。

本发明以申请人以专利号为ZL201410590216.8发明专利所述方法制备获取的胰腺脱细胞支架为基础，通过肝素化学交联到支架脉管系统表面组装到胰腺支架内部，该支架在一定时间内对肝素的缓释在脱细胞胰腺支架局部产生抗凝作用。再结合显微外科技术使胰腺组织植入大鼠体内，从而使血液在组织工程胰腺内部实现持续“灌注”，为构建的“植入体”即时、持续提供氧气和营养物质，并排出代谢产物。

采用本发明方法，使脱细胞胰腺局部抗凝（即肝素化的脱细胞胰腺基质具有抗凝作用），预防血凝块的形成将延长渗透距离和时间，为种子细胞存活提供理想环境，结合其他手术方法（如组织移植），使血液灌注进入组织工程胰腺内部，加速血管化的进程。同时，在本发明所述脱细胞支架材料上的肝素分子对周围邻近渗透或灌注再种植的内皮祖细胞具有选择性的捕获作用，能够促使其结合到支架材料上，进而在局部微环境中细胞因子的影响下表达生物活性物质，发挥内皮化作用。生物大分子负载修饰胰腺脱细胞支架脉管系统促进其内皮化是体外成功构建理想组织工程胰腺移植物的趋势和发展方向。本发明所述方法对于其他复杂器官如肝脏、肾脏等脱细胞支架的内皮化也同样具有积极指导意义。

本发明所述再内皮化胰腺脱细胞支架的优势在于：