[发明专利]一种牛跟腱Ⅰ型胶原的提取方法

说明书

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种牛跟腱Ⅰ型胶原的提取方法；该方法具体通过以下步骤实现的：将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块腱，碳酸氢钠水溶液浸泡、清洗，晾干得纯牛跟；将纯牛跟腱加入到含有三乙醇胺的肉豆蔻酸溶液中浸泡，清洗，晾干；将液氮中加入晾干的牛跟腱，研磨成粉末，得牛跟腱粉末；取牛跟腱粉末，加入醋酸‑醋酸钠缓冲溶液，加入胃蛋白酶，角鲨烯，搅拌均匀后，酶解，然后加入二巯基乙酸乙二醇酯，振荡反应，得酶解液；将酶解液盐析透析后，得牛跟腱Ⅰ型胶原。本发明提供的制备方法简单，对设备要求低；所得产品为高纯度的具有三螺旋结构的Ⅰ型胶原，不会对神经组织产生机械性损伤，生物相容性好。

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种牛跟腱Ⅰ型胶原的提取方法。

背景技术

胶原是脊椎动物体内含量最多的一类蛋白质，也是细胞外基质的四大组分之一。它含有一个或几个由α链组成的三螺旋结构的区域，该独特的三螺旋结构及其分子之间的共价交联，赋予胶原纤维极高的抗拉强度和热稳定性，也是胶原与细胞发挥相互作用的结构基础。

现有的提取方法中，提取的胶原纯度低，如何提取高纯度的具有三螺旋结构的Ⅰ型胶原成为了亟待解决的技术难题。硬脑膜/硬脊膜在外伤以及肿瘤侵及时，可能造成不同程度的脑膜/脊膜的损伤与缺损，继而导致脑脊液渗漏，继发感染。目前提取的材料可能会引起排斥反应，且由于局部组织的反应，可造成对脑组织的刺激，形成癜痕或包裹反应、脑膜炎症状或出血等严重并发症，目前的修复材料大都依赖进口，价格昂贵。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牛跟腱Ⅰ型胶原的提取方法，该方法简单且对设备要求低，制备的产品纯度及得率高。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种牛跟腱Ⅰ型胶原的提取方法，包括以下步骤：

（1）将新鲜牛跟腱洗净后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切块，加入碳酸氢钠水溶液浸泡16h，取出后去离子水清洗，晾干得纯牛跟腱；

（2）将纯牛跟腱加入到含有三乙醇胺的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去离子水清洗，晾干；

（3）将液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸腾后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；

（4）取20g牛跟腱粉末，加入1000mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入胃蛋白酶，角鲨烯，搅拌均匀后，在35-37℃下，搅拌酶解40-50h，然后加入二巯基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振荡反应2-3h，得酶解液；

（5）将酶解液盐析透析后，得牛跟腱Ⅰ型胶原。

进一步的，所述碳酸氢钠水溶液的质量分数为10%。

进一步的，所述肉豆蔻酸溶液的质量分数为5-8%。

上述每1L肉豆蔻酸溶液中含有三乙醇胺的含量为0.1-0.15g。

进一步的，所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH值为3.5。

进一步的，所述胃蛋白酶的加入量占牛跟腱粉末重量的0.6-0.8%。

进一步的，所述角鲨烯的加入量占牛跟腱粉末重量的0.2-0.3%。

进一步的，所述二巯基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的质量比为0.5：1。

本发明创造性的将牛跟腱浸泡于肉豆蔻酸溶液中，通过加入少量的三乙醇胺，能够对牛跟腱的脱脂处理更加彻底，去除绝大部分可溶性酯类等物质，提高后期的提取效率，同时提高产品的纯度。发明人经过大量实验发现，本发明提供的提取方法，能够提高酶解效率，减少酶解的时间，同时，能够提高所得产品的纯度。本发明所采用的盐析透析方法采用现有方法即可。

本发明的有益效果为：