[发明专利]一种在293FT细胞内表达成熟家蚕素Ⅱ的方法

说明书

本发明公开一种在293FT细胞内表达成熟家蚕素Ⅱ的方法。通过改造家蚕素Ⅱ基因表达B链蛋白与C链蛋白的相关基因的核苷酸序列，致使蛋白的氨基酸序列发生改变，使家蚕素基因在293FT细胞表达家蚕素原后，切掉C链，形成A与B链结合的成熟的家蚕素。从而在真核非内分泌细胞实现成熟家蚕素Ⅱ的表达，提供一种研究家蚕素的生物学功能所需研究材料来源的技术方法。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种在293FT真核细胞内表达出成熟家蚕素Ⅱ蛋白的方法。

背景技术

二十世纪早期，日本学者从家蚕的大脑中提取和鉴定了一个分子量大小约为5KD的多肽，该多肽能像家蚕促前胸腺激素（prothoracicotropic hormone ，PTTH）那样活化蓖麻蚕的前胸腺。随后证实5KD的肽作为家蚕生理剂量无生物活性，而是一个30KD的肽在家蚕本身具有生物活性。因此，生物学家们对5KD肽的基因结构与生物学功能进行了大量的研究，发现含有两条氨基酸链，A链与B链,其中A链由20个氨基酸组成,B链由26或28个氨基酸组成。家蚕素的A链与B链之间有两个二硫键相连,链自身由一个二硫键相连。家蚕素与人类胰岛素具有高度同源性,其A链与B链对应人胰岛素的A链与B链的相似度分别达50%和30%,第一次在分子水平证明无脊椎动物存在胰岛素或胰岛素相关肽，该蚕蛾胰岛素相关肽就是家蚕素（Bombyxin，Bbx）。

在研究家蚕素过程中，如何获得家蚕素蛋白是研究家蚕素生物学功能的关键步骤。当前获得家蚕素蛋白的方法包括：(1)通过生物化学方法从蚕蛾头部提取，其提取纯化流程已建立，但需要大量的蚕蛾才能获得微量的产物，有学者从65万头家蚕头部分离纯化出约50μg的多肽；（2）应用化学合成方法进行家蚕素蛋白的合成，该方法过程繁琐，同时由于蛋白的修饰问题，使其生物学活性受到一定影响。（3）基因工程方法进行蛋白表达。有研究报道采用昆虫杆状病毒进行家蚕素蛋白的表达。

应用基因工程进行蛋白的表达，此法简便，蛋白产量高，以及生物学活性高。赵红平等公开了通过对家蚕素基因改造应用大肠杆菌及酵母蛋白表达系统进行家蚕素Ⅱ与Ⅳ的表达，观察其抗肿瘤的功能（赵红平;冯西桥;龙燕等，一种重组家蚕素的表达方法及其抗肿瘤应用。CN201410079147.4）；李红霞等公开应用真核表达载体在293FT细胞内表达家蚕素Ⅱ（李洪霞，杜珍武，张玉成，等．家蚕素Ⅱ基因在293FT细胞的表达。中国老年学杂志，2011，31（4）：634-636）。但上述表达的家蚕素Ⅱ均为家蚕素原，不是去掉C肽的成熟的家蚕素。表达的家蚕素原不能有效显示成熟家蚕素功能。

家蚕素蛋白的表达具有与胰岛素表达相同的机制：先是基因转录，再翻译出前原家蚕素(preprobombyxin)，结构为信号肽(S57)—B 链(B84)—2个碱性氨基酸残基—C 肽(C63)—2个碱性氨基酸残基—A 链(A60)，然后，切除信号肽，形成一个链内二硫键和两个链间二硫键；最后切C 肽，生成成熟的家蚕素分子（mature bombyxin），家蚕素原由B 链、C肽与A 链组成。而成熟家蚕素不包括C 肽，由B 链与A 链组成。

在基因真核表达系统中，为提高基因表达的水平，采用的宿主细胞常为293FT细胞，该细胞是人胚肾细胞，为非内分泌细胞，缺乏C肽转化酶，因此直接应用家蚕素基因在该细胞内进行家蚕素表达，获得的家蚕素原的C肽不能有效被切除，从而不能合成成熟的家蚕素。因此本发明通过对家蚕素基因的改造，实现在293FT细胞内实现成熟家蚕素的表达。

发明内容

本发明提供的是一种在293FT细胞内表达成熟家蚕素Ⅱ的方法。

本发明采取如下对家蚕素基因改造，实现发明目的：

1.家蚕素Ⅱ基因表达A链蛋白的基因与表达C链蛋白的基因之间进行核苷酸序列改变，使其编码的蛋白为Furin蛋白的识别位点。

2.家蚕素Ⅱ基因表达B链蛋白的基因与表达C链蛋白的基因之间进行核苷酸序列改变，使其编码的蛋白为Furin蛋白的识别位点。