[发明专利]分子信标探针及引物对、VDR基因SNPs位点检测方法

说明书

本发明公开一组分子信标探针及引物对、VDR基因SNPs位点检测方法。该分子信标探针包括第一探针和第二探针；第一探针包含第一核心序列5’‑TGGGC[A/C]CCTCACTGCTCA‑3’，第二探针包含第二核心序列5’‑GGATGGCCTC[A/G]ATCAGC‑3’；同时，第一探针和第二探针的长度均为20‑30bp，Tm值均为62‑65℃，第一探针的5’端和3’端分别用第一荧光分子和第一淬灭分子标记，第二探针的5’端和3’端分别用第二荧光分子和第二淬灭分子标记。本发明仅需要qPCR仪和该两条荧光标记的探针就可实现对大量样本的VDR基因中两个重要多态性位点的分析，大大降低了检测成本和分析难度。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一组分子信标探针及引物对、VDR基因SNPs位点检测方法。

背景技术

维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)是细胞表面结合1,25-二羟维生素D(1,25-dihyroxyvitamin D，1,25(OH)₂D，也叫钙三醇，calcitriol)的受体。当VDR与激素性质的1,25(OH)₂D结合而活化后，便进入胞核内，与视黄醇-X受体形成异二聚体结合到特定基因的激素反应元件上，调节基因表达或转录抑制。因此，VDR也是一种核受体转录因子，即NR1I1(nuclear receptor subfamily 1,group I,member 1)，其调节的基因涉及钙磷代谢、细胞生长、增殖和凋亡，并进而与骨骼健康、免疫反应和肿瘤等过程相关。

VDR基因在人染色体上定位于12q13.11，具有500种以上的单核苷酸多态性位点和相应基因型，其中，Apa1、Cdx2、EcoRV、Bsm1、Fok1、Taq1、Tru9I是早期采用限制性酶切片段长度多态性分析发现的SNPs，并且在过去一段时间积累了大量关于它们和多种健康与疾病现象相关的报道。VDR的RNA产物由9个外显子构成，Apa1位点(rs7975232)位于第8号内含子3’端，为[A/C]二态性，Taq1位点(rs731236)位于第9号外显子5’端，为[C/T]二态性，二者相距较近。其中，在外显子上的Taq1多态性并不改变对应的异亮氨酸，为同义突变。但位于内含子上的SNPs或位于外显子上氨基酸不变的SNPs可能与mRNA转录、剪接、密码子翻译效率等过程相关，因此，仍可能影响疾病风险。

对Apa1和Taq1多态性的分析显示，二者与肺结核疗效、高加索人骨折与银屑病风险、胰岛素抵抗、哮喘和遗传过敏、腰椎病相关；Taq1可能与男性帕金森病、汉族2型糖尿病合并胫前皮肤黑斑、骨密度、高体质指数、系统性红斑狼疮预后等疾病风险相关；ApaI与亚洲人的牙龈炎、我国北方和土耳其人的银屑病、肾细胞癌和散发性前列腺癌有关。因此，对人群的这两个SNPs进行检测，对分析VDR与多种疾病风险和表型的相关性具有研究与预测价值。

虽然等位基因检测的方法有数十种，但针对VDR Apa1和Taq1两个SNPs的基因型分析，目前报道的方法主要是：聚合酶链式反应后的限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、TaqMan探针、高分辨率熔解曲线分析(HRM)、多重PCR结合标签阵列单碱基技术、时间飞行质谱法、测序等。PCR-RFLP虽然廉价，但其操作步骤繁琐，且需要两个独立的RFLP实验进行基因分型，在分析大量样本时，尤其费时。以TaqMan探针不论混合还是单独反应分析这两个SNPs，都需精心设计、测试多套探针，增加了试剂成本。HRM技术存在部分非典型曲线难以判断的不足。时间飞行质谱、测序等方法都依赖于昂贵的设备、封闭的试剂和较高的实验操作技术，甚至需要摸索建立适宜的检测条件；且因其单次运行所需试剂用量有最低要求，间歇与随时开机运行的成本较高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一组分子信标探针及引物对、VDR基因SNPs位点检测方法，旨在解决现有VDR基因SNPs位点检测步骤繁琐、耗时、成本高的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：