[发明专利]一种杂合抗菌肽及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种杂合抗菌肽及其制备方法和应用。所述杂合抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码该杂合抗菌肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。本发明通过体外构建多拷贝表达盒表达载体，获得含编码杂合抗菌肽基因的不同拷贝数表达盒的重组载体，进而得到了含不同拷贝数表达盒的重组载体的酵母转化子，通过甲醇诱导，在毕赤酵母宿主细胞中高效表达上述基因，获得了所述杂合抗菌肽。该制备方法可高效地制备所述杂合抗菌肽，所用培养条件简单，产量较高、成本较低，得到的杂合抗菌肽抗菌效果好，适合用作抗菌药物、饲料添加剂等。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种新型杂合抗菌肽其制备方法与应用。

背景技术

目前在水产品加工和养殖领域使用了大量的抗生素和防腐剂。虽然能起到良好的效果，但是会使细菌产生耐药性，影响水产品的品质。虽然天然抗菌类蛋白是抗生素和防腐剂的良好替代者，但是其在生物体中含量较低，从生物体内直接分离提取纯化的难度较大；并且对抗外源微生物的效果有限。尤其是目前还没有水产来源的商品化抗菌类蛋白。《GB2760-2014》中规定鸡蛋白溶菌酶不能使用在水产品中。美国FDA规定的可以使用在水产品中的饲料用抗生素也只有3种(人用抗生素不能用于养殖动物中，批准用作治疗鱼病的抗生素不得作为生长激素，也不得用于疾病预防。在美国仅有6种药品被准许使用在水产养殖业上，包括麻醉剂、驱虫剂及催产激素各1种，以及3种抗生素。而批准的抗生素中有一种已不再生产使用。所有的药品必须根据商标说明来使用。氧四环霉素及磺胺剂是被许可用于治疗鱼病的抗生素，但仅限于特定水产鱼种(如氧四环霉素仅能用在鲶鱼、鲑鱼及龙虾)或特定疾病上。)。因此以鱼类来源的天然抗菌肽为基础，在分子水平上设计杂合抗菌肽基因，并通过DNA重组技术进行大量制备，获得的杂合抗菌肽将具有增强的抗菌作用，以满足目前水产品养殖和保鲜的需求。但是目前有关鱼类来源抗菌肽开发利用的报道很少，有关鱼类来源杂合抗菌肽的报道更是鲜有耳闻。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种能高效表达外源蛋白的真核表达系统，但用于表达抗菌肽这种外源基因时，常常会出现表达水平低的问题。例如蔡晶晶等(蔡晶晶，杨明，蔡灵，郭庆，潘瑞珍，王克坚。黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达，厦门大学学报，2009，48(5)：738-743)在毕赤酵母中表达黑鲷抗菌肽hepcidin，其表达量在120h达到最高为1.1mg/L。Vasiliki Koliaraki等人(Vasiliki Koliaraki,MarthaMarinou,Martina Samiotaki,George Panayotou,Kostas Pantopoulos,AvgiMamalaki.Iron regulatory and bactericidal properties of human recombinanthepcidin expressed in Pichia pastoris.Biochimie2008；90:726-735)在毕赤酵母中表达得到人hepcidin，其在培养液中的表达量为5-7mg/L。Lei Wang等人(Lei Wang,Chun-eLai,Qifeng Wu,Junliang Liu,Maojun Zhou,Zhenghua Ren,Dandan Sun,Shangwu Chen,Anlong Xu.Production and characterization of a novel antimicrobial peptideHKABF by Pichia pastoris.Process Biochem 2008；43:1124-1131.)在毕赤酵母中表达黄金海马抗菌因子HKABF，其表达量为15mg/L。影响毕赤酵母表达量的因素有核苷酸序列(密码子的偏爱性、AT含量和二级结构)、基因拷贝数、分泌信号肽的特点、胞内蛋白酶的活性、甲醇利用表现型、宿主菌的生理状态和培养情况等。在这些因素中，基因拷贝数是最关键的一点。单拷贝基因表达蛋白时往往基因的转录水平是表达的限制步骤，因此，重组基因的多拷贝插入可能获得更高的蛋白产量，可以通过构建多拷贝表达盒表达载体来解决这个问题。