[发明专利]基于FTO基因的人类肥胖症斑马鱼模型的建立与应用

说明书

本发明涉及基于FTO基因的人类肥胖症斑马鱼模型的建立与应用，具体步骤包括针对斑马鱼fto基因编码关键功能结构域的外显子设计CRISPR序列，筛选确认可有效引导Cas9切割目标基因的活性sgRNA，然后运用有活性的sgRNA，制备fto基因敲除的初建者，待初建者生长至性成熟，令其自由交配，产生F1代；通过对F1个体的基因型鉴定，筛选fto基因敲除的斑马鱼突变体；通过对fto基因纯合突变的分析，确立fto的功能缺失有益于斑马鱼仔鱼的脂肪累积的减少，建立基于fto基因的人类肥胖症的斑马鱼模型，进而可将fto作为标识基因应用于筛选与建立治疗人类肥胖症的新药物与新方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及筛选确定可对斑马鱼fto基因进行基因组编辑的sgRNA序列、制备斑马鱼to基因靶向突变的优选方案，以及利用斑马鱼fto作为标志性基因筛选治疗人类肥胖症药物的斑马鱼模型的应用。

技术背景

肥胖是体内多余的脂肪堆积超过一定程度对人类健康造成困扰的能量代谢失衡的慢性疾病。人们通常用BMI(body mass index，体重指数)来判断个体是否肥胖。因体脂增加使体重超过标准体重20％或体重指数【BMI＝体重(Kg)/(身高)²(m²)】大于24者称为肥胖症。肥胖会增加其它疾病的患病几率，尤其是心脏病、II型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸窘迫、癌症和骨关节炎等疾病。近几十年来，肥胖症患者在全球范围内以惊人的速度增加。尤其是儿童、青少年肥胖增长日益迅猛(1，2)。在2014年约有600万成年人(13％) 和4200万5岁以下儿童患有肥胖症。肥胖被认为是21世纪最为严重的影响健康的疾病。

肥胖的病因主要分为外因和内因，外因以饮食过多，活动过少为主，热量摄入多余热量消耗，使脂肪合成增加(3，4)。而内因是要是由于遗传易感性引起的。类似于其它许多疾病，肥胖是遗传因素和环境因素之间相互作用的结果。人类的单纯性肥胖的发病有一定的遗传背景。许多基因存在的多态性控制着食欲和代谢从而在充足能量存在时更容易使体重增加从而易患肥胖症。在对家庭以及双胞胎的研究中表明， 40-70％的普通肥胖症患者属于遗传性肥胖(5，6)。截止到2006年，已经发现人类基因组上与肥胖症相关的多态性位点已经超过41个。2008年，人类筛选出第一个可导致人类肥胖症疾病的基因FTO(fat massand obesity associated gene)。Loos发现，FTO是一个肥胖易感基因，FTO基因第一个内含子的一些突变跟肥胖正相关。研究发现，FTO基因第一个内含子携带肥胖SNP的纯合人群的体重要比不携带SNP的人群平均重3-4kg，并且患肥胖的危险性要增加1.67倍(7)。在另外一篇关于FTO的报道中表明，FTO在第一个内含子内存在的一些SNP位点跟II型糖尿病疾病密切相关(8)。但通过控制病人BMI指数，发现这些病人的糖尿病表型消失，这说明，FTO的突变是通过影响体重来影响继发性的糖尿病疾病的。这些数据表明 FTO基因的突变跟肥胖症密切相关。