[发明专利]一种改进的转氨酶、其编码基因及表达该酶的基因工程菌

说明书

本发明涉及一种改进的转氨酶及其编码基因，并通过构建大肠杆菌基因工程菌实现该酶的异源表达。改进的转氨酶对应于野生型转氨酶的氨基酸序列的第53位为丝氨酸，第115位为丙氨酸，第214位为脯氨酸。与来源于烟曲霉菌Aspergillus fumigatus Af293的野生型转氨酶相比，在催化对甲基苯乙酮不对称转氨生成(R)‑(+)‑1‑对甲基苯乙胺方面，改进的转氨酶的催化效率至少为野生型转氨酶的2倍。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种改进的转氨酶、其编码基因以及表达该酶的基因工程菌。

背景技术

(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺作为一种药物中间体，在有机合成和药物合成方面有着广泛的应用。常温常压下(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺是一种无色液体，可溶于乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂溶剂中，其结构式如下所示：

目前公布的(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的合成方法以化学合成法为主，一种是利用手性拆分试剂对外消旋的1-(4-甲苯基)乙胺进行拆分，后经分离纯化获得手性纯的目标化合物(Tetrahedron:Asymmetry,2003,14,2683–2685)，该方法最终产率偏低(49.25％)，产物手性ee值为99％，反应过程使用的手性拆分试剂价格昂贵，生产成本较高。另一种是利用手性催化剂不对称催化对甲基苯乙酮合成(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺(Angew.Chem.,2003,115,5630–5632)，该方法产物手性纯度偏低(ee值为93％)，使用过渡金属[((R)-tol-binap)RuCl₂]作为手性催化剂，价格昂贵且回收困难，排放环境中易造成污染。

与化学合成法相比，生物合成法具有反应条件温和、转化率高和立体选择性强等优点，目前已报道的生物合成法主要是利用脂肪酶或转氨酶进行动力学拆分或不对称催化合成(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺。专利CN1177382报道了利用脂肪酶Novozym435水解外消旋N-[1-(4-甲基苯基)-乙基]-乙酰胺制备(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺，该方法最终产率(32％)和产物手性纯度(ee值90％)均较低。专利CN1346342中以外消旋胺和酯为原料在南极假丝酵母脂肪酶B的作用下生成光学手性R型的酰胺化合物后，在三乙醇胺存在下用NaOH水解得到目标化合物(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺，该方法涉及两步反应，最终产率仅为45％，产物ee值为95％。Smidt H等报道了以外消旋的1-(4-甲苯基)乙胺和乙酰氯为原料反应得到酰胺，再由南极假丝酵母脂肪酶B选择性水解制备(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的方法，但转化率较低，仅为31.7％，产物ee值为99％(Biotechnol Tech,1996,10(5),335-338)。利用脂肪酶进行动力学拆分制备目标化合物存在反应步骤多、产率低、手性选择性偏低等缺点，而转氨酶能够不对称催化潜手性酮类化合物一步合成手性胺类化合物，在制备手性胺化合物方面具有较好的应用前景。然而，现有的野生型的转氨酶在催化对甲基苯乙酮不对称合成(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺时催化效率很低。Giyoung Shin等以外消旋的1-(4-甲苯基)乙胺为原料，利用不同对映选择性的转氨酶一锅法制备目标化合物，其中S型和R型转氨酶分别来自Polaromonas sp.JS666和Mycobacterium vanbaalenii，利用该方法制备(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的手性纯度较高(ee值>99％)，但转化效率较低，0.5g/L的纯酶至少需要24h才能完全转化10mmol/L的底物(Chem.Commun.,2013,49(77),8629—8631)，无法满足工业化应用的需求。Peter Both等报道了一种以1-乙基-4-甲苯为原料通过多级酶促反应(单加氧酶、醇脱氢酶及转氨酶)得到目标化合物(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的方法(Angew.Chem.Int.Ed.,2016,55(4),1511–1513)，其中R型转氨酶来源于Arthrobacter sp，该方法最终转化率仅为5％，实际应用价值不大。目前，利用生物法制备合成(R)-(+)-1-对甲基苯乙胺的技术缺乏一种既具有一定立体选择性，又具有较好催化活性的酶。

发明内容