[发明专利]ERCC1基因多态性检测体系及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因多态性的检测产品以及该产品所用到的引物、探针、检测体系，属于生物技术领域。

背景技术

单核苷酸多态性(SNPs)是人类和动物的基因组中普遍存在的一种分子标记，通常是特定位点存在两个等位基因,研究表明，基因多态性与某些基因组DNA的修复功能有关，分子水平的疾病诊断可对肿瘤个体化治疗和预后判断提供指导。

切除修复交叉互补基团1(ERCC1)是核苷酸切除修复途径(NER)的关键酶，而核苷酸切除修复是人类最重要的DNA损伤修复机制，可以防止基因突变，主要修复累积性损伤，可切除几乎一切导致DNA螺旋扭曲的大分子致癌物。研究表明，ERCC1基因多态性可以影响核酸切除修复过程，并使其功能异常，基因不稳定增加，导致肿瘤的发生。ERCC1基因常见的一个单核苷酸多态性位点是第四外显子的118C>T多态性位点，该密码子C→T的产生的变异虽然属于同义突变，但是能够影响ERCC`蛋白水平的表达，即T等位基因的肿瘤患者的mRNA水平更高。临床上通过检测ERCC1的基因多态性，有助于帮助肿瘤患者预测铂类药物化疗的预后，指导用药和个性化治疗。目前主要测采用一代测序、FLP、等位基因特异的寡核苷酸杂交、等位基因特异的PCR和基因芯片等技术，但是操作过程繁琐，需要更换反应管而易发生污染，多需要电泳和多步后处理，影响检测结果的准确性。或仪器设备昂贵，难以大规模推广应用。

传统的巢式PCR反应由于有2次PCR扩增，不但耗时、开管操作极易造成交叉污染导致假阳性及结果的不准确性，而检测结果需要电泳及凝胶成像系统才能看到结果，从而降低了扩增多个靶点的可能性，从PCR到检测结果出来大约需要5h，主要应用于分子生物学领域和医学检测研究中。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能在样本初始模板量低的条件下准确检测出样本基因ERCC1的C118T多态位点的基因型的ERCC1基因多态性检测试剂盒，以及该试剂盒所用的检测体系。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种ERCC1基因多态性检测体系，包括检测引物对、检测探针和肽核酸，

所述检测引物对包括检测ERCC1基因C118T多态性位点外侧的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的外侧上游引物、检测ERCC1基因C118T多态性位点外侧的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的外侧下游引物、检测ERCC1基因C118T多态性位点内侧的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的内侧上游引物、检测ERCC1基因C118T多态性位点内侧的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的内侧下游引物；所述外侧上下游引物引入脱氧次黄嘌呤；

所述检测探针包括检测ERCC1基因C118T多态性位点为野生型的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的野生型探针和检测ERCC1基因C118T多态性位点为纯合子的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的纯合子探针；所述野生型探针和纯合子探针引入脱氧次黄嘌呤和错配碱基；所述肽核酸包括与检测ERCC1基因C118T多态性位点的内侧上游引物部分互补的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的肽核酸和与检测ERCC1基因C118T多态性位点的内侧下游引物部分互补的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的肽核酸。

上述ERCC1基因多态性检测体系还包括内参引物对、内参探针、质控引物对和质控探针；

所述内参引物上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；

所述质控上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，所述质控下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。

上述各个探针的5’端设有荧光报告基团，所述各个探针的3’端设有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团是FAM、HEX、ROX或Cy5，所述荧光淬灭基团是BHQ1、BHQ2或TAMRA。

上述外侧上下游引物在反应体系中的最终浓度0.05μm/l，所述内侧上下游引物在反应体系中的最终浓度0.19μm/l，所述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1nm/l，所述野生型探针在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l，所述纯合子探针在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l；