[发明专利]耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本技术属于耐药致病菌快速检测领域。涉及微流控芯片快速检测技术，提供了一种耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒及检测方法，所述耐药基因涉及IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA特定基因保守序列具有的特异性引物和引物组；还涉及将引物和引物组用于等温扩增法检测IMP、OXA-51、KPC、SIM、VIM、OXA-58、OXA-48、OPrD2、NDM、OXA-23、van-A、van-B、mecA的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

抗生素自1943年应用于临床，便成为我们治疗致病菌感染不可或缺的临床药物。最初在应对致病菌感染中抗生素是一种绝佳的药物。但在近些年，抗生素对致病菌的治疗效果越来越差，此类药物虽然在不断的更新迭代，更有诸多广谱抗生素推出市场，但是细菌的耐药性仍然是医学界的一个难题。人体被致病菌感染后，医生如果不能使用正确的抗生素进行治疗，不仅花费了大量的治疗费用，且不能达到治疗的目的，还有可能杀死身体中的益生菌，使得部分条件致病菌产生致病性，甚至形成“超级细菌”。超级细菌为多重耐药菌，对多种抗生素都有耐药性，对许多新型广谱抗生素也耐药。细菌的耐药性越强对病人的威胁就越大。

MRSA菌是一种“超级细菌”，从外界获得mecA被认为是其青霉素耐药的关键。mecA基因编码的青霉素结合蛋白PBP2a对β-内酰胺类抗生素具有较低亲和力，从而使MRSA对甲氧西林耐药。1961年首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，之后在世界各地都相继报道了MRSA感染的病例。流行病学调查显示2004年MRSA在美国大部分医院感染率都超过50％，而2005年又增长了30％。在我国，上世纪七十年代报道MRSA感染以来，呈逐年快速上升趋势，2008年MRSA全国发生率为67.6％，个别地区达到80％以上。

传统病原菌耐药检测是通过培养法，需要一个3-5天的培养周期，然后再通过纸片扩散法、K-B法、定量测定稀释法来分析药物的耐药性，此过程检验周期长，需要专业的生物学人员操作。由于细菌可能在培养过程中产生耐药，容易出现假阳性。对于患者而言，检测周期的时间长短意味着能否得到及时治疗或减少并发症的发生。所以，在当前医疗卫生重心转移的大背景下，在临床上尤其是基层医疗机构对快速准确，操作简单，实验环境要求低的诊断产品具有迫切需求。

其中，现有技术CN102952875A提供了一种细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒。该试剂盒包括扩增待测细菌耐药基因的引物对和检测探针。该基因芯片包括检测待测细菌耐药基因的探针。利用该试剂盒和基因芯片进行耐药基因检测的方法，包括步骤：1)利用试剂盒中的引物，PCR扩增待测样本DNA中的耐药基因；2)扩增产物与试剂盒中的检测探针进行荧光标记反应；3)荧光标记的扩增产物与基因芯片进行杂交，确定样本所含耐药基因。该方法包括核酸提取、多重PCR和荧光标记反应、基因芯片预处理、荧光标记的多重PCR产物与芯片的杂交反应、芯片扫描和结果分析五个步骤操作复杂。且每个步骤都需要诸多的仪器和苛刻的实验环境，很容易遭成扩增产物污染，出现结果假阳性。另外与科研单位相比医院检验科实验用仪器较少，尤其是区域型小医院没有经费及条件购置多通道PCR仪，且该方案中原材料包括探针，探针的成本较高将导致产品售价过高，超出部分患者接受范围不利于该试剂盒推广。

现有技术CN104313166A一种铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片检测试剂盒，所述铜绿假单胞菌多重耐药基因包括OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因，试剂盒包括核酸扩增组份和杂交组份；核酸扩增组份具体包括：预混液、引物混合液、聚合酶、阳性质控品、阴性质控品；杂交组份具体包括：微球杂交液、质控微球和链霉亲和素-藻红蛋白。该方案中的探针及微球都是价格较贵的原料，荧光定量PCR仪的价格较高，需要经培训的专业人士操作，部分医院更没有相关仪器，另外该方法PCR过程中设计较多升降温过程，使得整个实验时间周期较长。

本发明所开发的耐药基因微流控芯片快速检测试剂盒(恒温扩增芯片法)，结合了恒温扩增技术，实时荧光技术和微流控芯片技术，对下待检耐药样本中的核酸进行检测，特异性好，灵敏度高，操作简单，检测迅速。

发明内容