[发明专利]一种便捷的MDA‑MB‑231乳腺癌细胞的冻存方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，具体地，涉及一种便捷的MDA-MB-231乳腺癌细胞的冻存方法。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的癌症，主要包括导管癌和小叶癌。2016年美国CA（A Cancer Journal for Clinicians）公布的最新统计数据显示，美国2016年预计将有420840例女性患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的38%，居女性恶性肿瘤发病率第一位，并且死亡人数将达52930例。更为严重的是全球的乳腺癌发病率正在逐年增长。

细胞培养是生物与健康相关研究领域的一项重要技术。随着生命科学的迅速发展，目前细胞培养已成为细胞生物学、分子生物学、遗传学和免疫学等学科研究的重要基础。为了深入探讨细胞的生长活动规律、有关疾病的病理和药物的药理（毒理）机制，开发具有不同针对性的细胞培养方法具有重要意义。

其中，MDA-MB-231乳腺癌细胞作为人源性高转移乳腺癌细胞，常用于乳腺癌的体内外研究。然而，随着研究过程中越来越多的运用组织细胞培养增殖技术，将MDA-MB-231乳腺癌细胞采用低温度进行长期保存数月、数年、数十年甚至数百年，一旦需要，可随时对所保存的细胞进行复苏，恢复其完整的形态结构与生物学特性，供生命科学研究实验。

发明内容

发明目的：本发明提供了一种便捷的MDA-MB-231乳腺癌细胞的冻存方法，用于多种人源以及非人源细胞的培养。

技术方案：本发明提供了一种便捷的MDA-MB-231乳腺癌细胞的冻存方法，包括以下步骤：用移液枪将培养基吸尽，加入3-5ml PBS洗涤MDA-MB-231乳腺癌细胞2-3次，向细胞培养皿中加入1-2ml 0.38%的胰蛋白酶，于37℃条件下消化3-5min，加入2-3ml的新鲜的MDA-MB-231乳腺癌细胞专用培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底部40-50次；将液体移至细胞离心管中，在1000-1500g/min条件下离心3-10min，用移液枪去除上清液，加入MDA-MB-231乳腺癌细胞专用冻存液，使用移液枪上下吹打MDA-MB-231乳腺癌细胞40-50次，加入到细胞冻存管中，拧紧冻存管盖，用封口膜封住冻存管；在2-7℃保存10-30min，再于-15 - -20℃保存40-60min，然后移入到≤-80℃环境进行细胞冻存；其中所述MDA-MB-231乳腺癌细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟甲基淀粉2-5份、海藻糖3-12份、维生素E0.5-3份、25%山梨醇1-5份、丙二醇0.8-1.6份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷0.5-2份和基础培养基80-90份。本发明所述的便捷的的细胞冻存方法，安全性、稳定性好，冻存后的细胞复苏后存活率高，其中MDA-MB-231乳腺癌细胞专用冻存液，组分合理，营养丰富，其中，25%山梨醇为渗透性保护液，而(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷则抑制细胞活动和基因表达，维生素E的抗氧化性好，在保证休眠细胞的营养的同时还可以显著减少对细胞的损伤，提高冻存细胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的状态。

进一步的，上述的便捷的MDA-MB-231乳腺癌细胞的冻存方法，冻存的MDA-MB-231乳腺癌细胞在≤-80℃环境过夜冻存后，第二天放入液氮罐中在液氮浸没于液氮中进行细胞冻存。液氮中保存可以进一步延长MDA-MB-231乳腺癌细胞的保存时间，可以在数年、数十年后仍然保持很好的细胞存活率以及细胞活性。

进一步的，上述的便捷的MDA-MB-231乳腺癌细胞的冻存方法，每支冻存管中MDA-MB-231乳腺癌细胞冻存密度为10⁵-10⁶个细胞。细胞密度合理，可以有效保证细胞的存活率及细胞活性。

进一步的，上述的便捷的MDA-MB-231乳腺癌细胞的冻存方法，所述胰蛋白酶中还包含0.5%的EDTA。可以与胰蛋白酶相配合，迅速使贴壁细胞脱离培养皿，减少胰蛋白酶对细胞的损伤。

进一步的，上述的便捷的MDA-MB-231乳腺癌细胞的冻存方法，所述MDA-MB-231乳腺癌细胞专用培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。胎牛血清可以进一步为培养的细胞提供营养物质，同时还能终止胰蛋白酶的消化作用。