[发明专利]基于His标签的PNGaseF固定方法

权利要求书

1.一种基于His标签的PNGase F固定方法，其特征在于：该方法将His标签的PNGase F与含有修饰IDA/Ni的磁性颗粒进行固定，具体包括如下步骤：

(1)固定相MNP-IDA/Ni置于离心管中，磁分离，弃上清；然后加入耦联反应液重悬固定相，磁分离，弃上清，使用耦联缓冲液清洗三次；

所述耦联反应液为20mM Tris、50mMNaCl、pH 7.5；

(2)步骤(1)的MNP-IDA/Ni中加入带有His标签的PNGase F酶液，4℃，100rpm/min反应60min，所述MNP-IDA/Ni与PNGase F酶的体积比为5:2；

(3)固定后的MNP-IDA/Ni-PNGase F置于磁场中分离，弃上清,然后加入耦联反应液重悬MNP-IDA/Ni-PNGase F，清洗MNP-IDA/Ni-PNGase F，磁分离，弃上清，使用耦联反应液清洗3次。

2.如权利要求1所述的一种基于His标签的PNGase F固定方法，其特征在于：步骤(2)中所述带有His标签的PNGase F酶液的制备方法为：

A、PNGase F酶所属的E.coli DE3细胞培养于含有卡那霉素的LB培养基，当培养细胞浓度的OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mM，250rpm/min，37℃条件下诱导3小时；

B、8000rpm/min离心10min，收集步骤A诱导表达的细胞，弃培养基上清，使用裂解缓冲液重悬细胞沉淀；

所述裂解缓冲液为20mM Tris,50mMNaCl,5mM EDTA,5％Glycorel，pH 7.5；

C、步骤B的重悬液置于冰上超声破碎20min，3s超声/3s间歇；

D、以12000rpm/min离心10min，分离步骤C破碎后的细胞裂解液，弃上清；

E、将步骤D的沉淀再次使用裂解缓冲液重悬，12000rpm/min离心10min，分离并收集沉淀；

F、重复步骤E三次；

G、使用漂洗缓冲液再次重悬并漂洗步骤F的沉淀，12000rpm/min离心10min，分离并收集沉淀；

所述漂洗缓冲液为20mM Tris,50mMNaCl,5mM EDTA,5％Glycorel，4M Urea，pH 7.5；

H、使用变性缓冲液再次重悬步骤G的沉淀，并转移至摇床100rpm/min，37℃变性30min；

所述变性缓冲液为20mM Tris,50mMNaCl,5mM EDTA,5％Glycorel，8M Urea，pH 7.5；

I、12000rpm/min离心10min，分离步骤H变性后的溶液，上清转移至透析袋，透析至保存缓冲液，所述保存缓冲液为20mM TrispH 7.5。

3.一种基于His标签的PNGase F的使用方法，其特征在于：RNase B变性后，加入相同量的MNP-IDA/Ni-PNGase F重悬液，然后将反应混合液置于微波的高火档位下进行酶切，微波10s、1-9次或者在250rpm，37℃恒温摇床中反应4-10min。