[发明专利]一种可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体来说，涉及一种可视化基因芯片检测肺部感染病原菌的方法。

背景技术

长期以来，呼吸道病原体引起的急性重症肺部感染一直是威胁人类健康的重要疾病，如不能得到及时有效救治，不仅可引起呼吸衰竭，还可导致多器官功能障碍，严重威胁患者生命，近20年来，肺部感染的细菌谱发生了变化，是当前医务工作者面临的严峻挑战。对病原菌进行快速、准确的检测，是临床诊治肺部感染的前提与关键，对于降低患者死亡率，减少住院时间、降低住院费用及避免医疗资源的浪费具有重要意义。

目前我国对于感染性疾病的病原菌检测、鉴定手段仍停留在培养、血清和生化检测水平。病原菌检测的经典方法是细菌培养，其作为病原菌检测的“金标准”，至少需要3-5天时间，对于一些非典型菌株培养则需时间更长，不能在第一时间给临床医生提供详尽的病原菌信息，导致临床治疗多仅凭经验用药，严重影响治疗准确性及效果。近年来，分子生物学技术在病原学检测方面得到了迅猛发展，PCR等虽然有较好的特异性及灵敏性，但每次只能检测一种或几种致病菌，存在通量低的缺陷，只能作为常规检测方法的补充和辅助。因此，临床迫切需要对肺部感染的病原体进行快速、准确的检测，以指导抗感染药物选择，提高临床治疗效果。利用高新分子生物学技术，建立多种感染性致病菌的快速、准确、高通量的检测方法，使之操作简便、适合临床应用，确保临床医生在较短的时间内准确获得病原菌结果，对于提高肺部感染的诊治和防控能力，防止疾病的传播，都具有重要的价值。

基因芯片技术为病原微生物的诊断提供了一种强有力的手段。基因芯片(Gene chip)又称为DNA微阵列(DNA microarray)，该技术采用原位合成或微量点样方法，将大量DNA探针如基因片段、人工合成的寡核苷酸等有序固定在载体(玻璃、硅片、尼龙膜等表面)与标记的核酸样品杂交后通过计算机等信号处理系统获取样品核酸序列信息。与传统的检测技术相比较，具有准确、快速、高通量、平行化等无可比拟的优点，可以在短时间内对多个基因进行准确检测，应用该技术进行细菌检测鉴定已显示出良好的应用前景。

基因芯片技术主要包括四个技术环节：芯片微阵列制备、样品制备、生物分子反应、信号的检测与分析。基因芯片上的探针设计是决定芯片检测效能的关键因素之一，16S rRNA基因在细菌的分类鉴定学上具有重要的生物学意义，其在生物进化过程中比其他基因演变得慢，被称为“细菌进化的活化石。迄今为止，几乎所有已知细菌16S rRNA基因的碱基序列已被测定并存入基因库。一般认为，对于同一种细菌其基因组的同源性应大于70％，对16SrRNA而言，如果出现3个以上碱基差异就可断定细菌不属于同一种属，因此，可设计出针对所有细菌共同的PCR反应引物。基因芯片用于细菌分类鉴定，常用的检测区域和目的基因有：16S rRNA、23S rRNA、16S～23S rRNA ISR(基因间隔区)等。但现有的序列特异性探针设计算法缺乏足够的覆盖度、灵活性以及效率，不能满足大规模细菌检测基因芯片的设计要求，而采用计算机设计的基于相对熵和遗传算法的组合探针设计，使得基于组合探针识别的大规模细菌分类16S rRNA基因芯片设计成为可能。

芯片的信号采集和分析方法是获得病原菌感染结果的关键步骤。目前，荧光检测法是基因芯片常规检测方法，方法成熟、简便，能够达到一般的检测要求，但有机荧光染料有自身难以克服的缺点：易淬灭、信号强度低等，在各种环境中稳定性差，影响检测信号的均一性和实验重现性，其最大的缺点是检测仪器的昂贵、体积笨重，检测成本较高，限制了基因芯片的临床及现场检测中的应用与推广，也是生物芯片技术发展面临的瓶颈问题。为解决这个问题，国内外学者探索研究基因芯片的可视化技术。可视化芯片即可用肉眼直接观察到生物大分子的反应信号，其原理是在酶的催化作用下产生的沉淀，沉积在芯片表面，使芯片的厚度发生变化，致使反射在芯片上的光的波长发生改变，由此可以通过芯片上颜色的变化来观察实验结果。