[发明专利]732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法

说明书

本发明涉及一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ‑氨基丁酸的方法，属于绿色生物制造技术领域；本发明分别以并联排列的732阳离子交换树脂柱Ⅰ和Ⅱ通过阀门控制交替作为辅助反应柱与固定化屎肠球菌细胞柱相偶联，并与其他辅助设施或设备连接形成循环反应系统，通过底物在732树脂辅助反应柱和固定化屎肠球菌细胞反应柱之间循环而进行高效催化反应，提高γ‑氨基丁酸产率；在一根732树脂柱辅助转化反应的同时，对另一根732树脂柱进行洗脱、再生和平衡，从而实现固定化屎肠球菌细胞柱在732树脂柱辅助下进行连续生产。与仅采用固定化细胞的单柱反应法相比，本发明提供的方法在相同反应时间和同等固定化屎肠球菌的条件下，单批循环的GABA产量提高178.83%。

技术领域

本发明涉及一种以732树脂连续循环辅助固定化细胞制备γ-氨基丁酸的方法，属于绿色生物制造领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)是一种具有4个碳原子的非蛋白质组成氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统主要的抑制性神经递质，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗癌、降血压、镇静和改善睡眠等作用，已成为备受关注的药品和保健品成分。由于可以通过内酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，因此GABA还是生产生物塑料聚酰胺4的重要原料。

微生物生长繁殖快，以其生产GABA不受时间和空间限制，因此通过微生物 GAD(Glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)生产GABA备受关注。GAD是一种依赖于磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate，PLP)的裂解酶，存在于细胞质中，是生物体催化L-谷氨酸(L-Glutamic acid,L-Glu)发生α-羧基脱羧作用生成GABA的唯一酶。由于GAD作用的底物(L-Glu)和产物(GABA)均为小分子，可以透过细胞膜，因此可以直接采用细胞转化法生产GABA，减少胞内酶的提取成本，简化生产工艺。已有文献通过唾液链球菌嗜热亚种、戊糖片球菌、屎肠球菌、短小乳杆菌、大肠杆菌细胞转化法制备GABA的报道。但是由于游离细胞不易回收重复使用，因此仍需要不断重复培养高GAD活力的细胞用于生产，而通过固定化技术将细胞固定或包埋于固态载体上，即制备成固定化细胞，则可克服游离细胞的缺点，并可实现连续化生产。

赵景联等在文摘(生物工程学报，1989,5(2)：124-128)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1％谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产GABA。间歇反应5h转化率达到了100％；连续搅拌式反应在三角瓶反应器中进行，以6mL/h的流速输入底物溶液和输出反应液，转化率达85％；连续柱式反应器中进行，控制流速12mL/h，转化率达95％。

章汝平等在文摘(长沙电力学院学报(自然科学版)，1998,13(4)：433-435)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产GABA，获得了GABA含量达到了98.94％，收率为49.65％。

杨胜远等在中国专利(专利号200910114016.4)中公开了一种细胞转化法生产GABA的方法，它是以乳酸乳球菌的细胞作用于外源添加的谷氨酸或谷氨酸钠，生产高含量的GABA，或将乳酸乳球菌细胞采用海藻酸钠进行固定化，通过固定化细胞技术转化谷氨酸或谷氨酸钠生产GABA。

焦阳、汪建敏和杨胜远等在文摘(核农学报，2009，23(6):1026-1031)中以唾液链球菌嗜热亚种Y-2为供试菌，考察了卡拉胶、明胶和海藻酸钙等材料将此菌株固定化的效果，并通过比较固定化细胞的GAD活性及γ-氨基丁酸的产量和载体机械强度，确定了海藻酸钙作为固定化细胞的适宜载体。优化后得到的最适固定化条件(w/v)为：海藻酸钠2％，CaCl2 14％, 菌体25％，凝胶平均颗粒直径1.64mm，在此条件下测得固定化细胞的GAD活性为游离细胞的1.2倍。细胞多批次应用稳定性试验证明：固定化细胞较游离细胞有着更稳定的GAD活性，反复使用60h后，固定化细胞GAD活性仍能保持其初始活性的90％以上，γ-氨基丁酸的积累量达到7.97g/L。