[发明专利]一种产朊假丝酵母游离型表达载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种产朊假丝酵母游离型表达载体，其特征在于，以毕赤酵母表达型载体pGAPZαA为基本骨架，利用G418抗性基因替换pGAPZαA载体上的博来霉素基因，将产朊假丝酵母的自主复制序列插入pGAPZαA载体的PscI位点中；还利用产朊假丝酵母的启动子、酿酒酵母的启动子或毕赤酵母的启动子替换pGAPZαA载体上的GAP启动子；所述产朊假丝酵母的自主复制序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

2.根据权利要求1所述的一种产朊假丝酵母游离型表达载体，其特征在于，所述产朊假丝酵母的启动子为甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、磷酸甘油酸激酶启动子或麦芽糖启动子。

3.根据权利要求1所述的一种产朊假丝酵母游离型表达载体，其特征在于，所述酿酒酵母的启动子为氨基酸通透酶启动子、转录伸长因子EF-1α启动子、磷酸丙糖脱氢酶启动子、磷酸甘油酸激酶启动子、乙醇脱氢酶启动子、己糖转运蛋白启动子或β-半乳糖激酶启动子。

4.根据权利要求1所述的一种产朊假丝酵母游离型表达载体，其特征在于，所述毕赤酵母的启动子为甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、醇氧化酶1启动子或甲醛脱氢酶启动子。

5.根据权利要求1所述的一种产朊假丝酵母游离型表达载体，其特征在于，所述表达载体的序列为SEQ ID NO.46-SEQ ID NO.58所示。

6.根据权利要求1所述的一种产朊假丝酵母游离型表达载体的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

S1.以质粒pScIKP和酿酒酵母基因组为模板，运用PCR技术分别扩增G418抗性基因编码区以及CYC终止子的部分片段，然后利用重叠PCR将G418基因的编码区与CYCTT部分片段连接，得到G418-CYCTT片段；

S2.以产朊假丝酵母GIM2.176基因组DNA为模板，运用PCR扩增获得产朊假丝酵母的自主复制序列，然后利用定点突变技术，消除序列中的PscI位点，得到所述产朊假丝酵母的自主复制序列；

S3.根据产朊假丝酵母的启动子、酿酒酵母的启动子和毕赤酵母的启动子的已知序列设计扩增引物，并分别在上下游引物5’端附加20bp的加上同源短重叠序列；

S4.分别以产朊假丝酵母GIM2.176、酿酒酵母As2.489、毕赤酵母x33的基因组DNA为模板，利用上述步骤S3所得的引物，通过PCR扩增获得所述产朊假丝酵母的启动子、酿酒酵母的启动子和毕赤酵母的启动子的片段；

S5.使用EcoRV和NcoI、或与其具有相同识别序列或产生相同粘性末端的限制性内切酶，将上述步骤S1所得G418-CYCTT片段及现有载体pGAPZαA进行双酶切后，进行连接并转化大肠杆菌DH5α，得到载体pGAPGαA；

S6.使用PscI或与其具有相同识别序列或产生相同粘性末端的限制性内切酶，将上述步骤S2所得的产朊假丝酵母的自主复制序列片段及上述步骤S5所得pGAPGαA进行单酶切后，进行连接并转化大肠杆菌DH5α，得到载体pCuGAPGαA；

S7.使用Bsp119I和BglII、或与其具有相同识别序列或产生相同粘性末端的限制性内切酶，将上述步骤S6所得载体pCuGAPGαA进行双酶切，然后运用Gibson组装技术，将上述步骤S4所得各启动子片段与酶切后的载体相连接并转化大肠杆菌DH5α，即得到一系列产朊假丝酵母游离表达载体。

7.根据权利要求5所述的一种产朊假丝酵母游离型表达载体的构建方法，其特征在于，步骤S5所述限制性内切酶为EcoRV和NcoI，或与其具有相同识别序列或产生相同粘性末端的限制性内切酶。

8.根据权利要求5所述的一种产朊假丝酵母游离型表达载体的构建方法，其特征在于，步骤S7所述限制性内切酶为Bsp119I和BglII，或与其具有相同识别序列或产生相同粘性末端的限制性内切酶。