[发明专利]一种新型的15种人乳头瘤病毒亚型分型试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术和基因检测领域，具体是一种新型的用于15种人乳头瘤病毒亚型分型的试剂盒和方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papilloma virus,HPV)属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。人乳头瘤病毒通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

对于感染生殖道和肛门的人乳头瘤病毒，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。在有性生活史的女性中生殖道人乳头瘤病毒感染具有普遍性，据统计70％～80％的女性在其一生中会有至少一次的人乳头瘤病毒感染，但大多数感染为自限性，超过90％的感染的女性会出现一种有效的免疫应答，在没有任何长期的健康干预时在6到24个月之间可以清除感染。而持续性的高危型人乳头瘤病毒感染则是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型人乳头瘤病毒DNA的存在，其中人乳头瘤病毒16型、18型、45型和31型感染占80％。低危型人乳头瘤病毒一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌。国家CFDA也已经颁布了人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型试剂技术审查指导原则，说明人乳头瘤病毒检测具有十分重要的临床意义。

根据HPV的同源性，已发现120多种型别。目前，市场上已经存在一些对人乳头瘤病毒进行检测的试剂盒，但是这些试剂盒通常是借助于荧光或者膜杂交的方式完成检测。

纳米金探针法区分不同亚型的病毒的步骤主要有以下三个阶段，而这三个阶段均是在同管闭管条件下完成的。第一阶段：模板扩增，通过引物对、扩增酶的参与，实现对目标模板的高灵敏扩增；第二阶段：通过探针和内切酶的参与，实现对目标模板向信号分子的的高效率转化；第三阶段：通过纳米金探针实现对信号分子的高分辨识别。但由于涉及到多种型别的区分，检测时复杂，耗时耗力。

同时，市场上尚没有将数学排列组合的算法与纳米金探针法检测方法相结合的人乳头瘤病毒分型方法，只需要普通的PCR循环仪器就能以较少的管数分型更多的人乳头瘤病毒亚型数，如以6管检测反应实现15种亚型的人乳头瘤病毒分型。

发明内容

基于此，本发明的目的提供一种15种HPV亚型的分型试剂盒和分型方法，其为将数学排列组合的算法与纳米金探针法检测方法相结合，在无需增加通量的情况下、实现以较少的检测反应管数(6管)区分15种的HPV亚型，这一方式在分型数量越多时所起到的作用就越显著。

实现以上目的的技术方案如下。

一种15种HPV亚型的分型试剂盒，包括以下至少5个检测管，其中，

第一管包含有对应的检测引物和针对5种型号的探针；

第二管包含有对应的检测引物和针对4种型号的检测探针，第二管中所针对的探针的型号只有一种与第一管中的型号相同；

第三管包含有对应的检测引物和针对5种型号的探针，第三管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同；

第四管包含有对应的检测引物和针对5种型号的检测探针，第四管中所针对的检测引物和探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，且只有一种与第二管中的型号相同，且只有一种与第三管中的型号相同；

第五管包含有对应的检测引物和针对5种型号的检测探针，第五管中所针对的检测探针的型号只有一种与第一管中的型号相同，只有一种与第三管中的型号相同，且只有一种与第四管中的型号相同。

在其中一个实施例中，还包括有第六管，所述第六管包含对应的检测引物和针对阳性对照的检测探针。

在其中一个实施例中，所述15种HPV亚型为6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、52、53、56、和58。