[发明专利]一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法

说明书

本发明公开了一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，属于冠状病毒反向遗传技术领域。所述构建方法包括：以BAC载体为骨架，运用体外同源重组技术，快速完成包含禽传染性支气管炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建，将构建的重组质粒直接转染细胞，在细胞内转录获得具有感染性的转录本，并完成病毒包装，将细胞与培养基的混合液接种SPF鸡胚并传代，获得禽传染性支气管炎病毒反向遗传株。该构建方法操作简单，阳性克隆率高，而且获得的反向遗传株具有传代稳定性，为体外研究病毒的致病机理、开发新型疫苗等提供了有效的工具；本发明利用5’添加的CMV启动子，在细胞内进行转录，利用3’添加的HDVR序列，大大提高了病毒的拯救效率。

技术领域

本发明涉及冠状病毒反向遗传技术领域，具体涉及一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法。

背景技术

禽传染性支气管炎(avian infectious bronchitis,IB)是危害养禽业的重大传染病之一，它是由禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种高度接触性传染病，以呼吸道症状、产蛋鸡产蛋量下降、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征。IBV在全球流行，并且由于不同IBV毒株在致病性和组织嗜性上差异大，血清型极其复杂，不同的血清型之间缺乏有效的交叉保护，加上新的变异株不断出现，导致IBV的防控非常困难。

IB的病原IBV属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属中的γ属冠状病毒的成员。病毒粒子略呈球形，有的呈多形性，直径约为80-120nm。基因组为不分节段的单股正链RNA，与核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)结合形成螺旋状的核衣壳；其外包裹一层由膜蛋白(Membrane,M)构成的囊膜；小分子蛋白(Envelope,E)镶嵌于囊膜中；由S1和S2两个亚基组成的梨状的纤突蛋白(Spike,S)在囊膜中铆定并伸展形成突起。IBV的基因组RNA全长27000nt左右，编码结构蛋白、非结构蛋白和一些附属蛋白。

反向遗传操作技术(reverse genetics)，即病毒的全长感染性cDNA克隆技术，包括病毒基因组全长cDNA克隆构建技术和由cDNA转录病毒RNA的感染性转录本制备技术，能在病毒DNA水平上对其进行人工操作，解决了RNA病毒基因组难以操作的难题。基于构建病毒基因组全长cDNA感染性克隆的反向遗传方法成为研究冠状病毒分子生物学的一个有效的工具。借助感染性克隆在体外对冠状病毒的基因组进行基因敲除、定点诱变等人工操作，可深入了解病毒生命活动过程中各种基因的调控作用，以及病毒的致病机理。

但是目前仍然存在一些问题阻碍了冠状病毒全长感染性cDNA克隆的构建，例如冠状病毒的基因组是目前已知的RNA病毒中最大的(27-32kb)，常规技术很难操作、一些复制酶基因cDNA克隆在细菌中具有不稳定性、在体外得到的转录本具有异质性等。获得基因组cDNA全长片段克隆是病毒拯救技术的关键环节，大多数研究者均采取分段克隆的策略，为了避免病毒序列在细菌中的不稳定问题，研究者通常扩增小片段(2K-3K)，通过小片段连接成大片段(5K-7K)，制备大量的大片段模板，最后将大片段通过酶切连接的方法得到全长cDNA克隆。

如《鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建术》公开了一种构建IBV感染性克隆的方法，具体公开：利用酶切连接获得病毒基因组全长cDNA，通过T7RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA，转染BHK-21细胞并进行病毒拯救。但该方法酶切位点选取限制较多，而且体外将多个大片段进行连接效率较低，获得病毒基因组全长cDNA非常困难。此外利用添加的T7启动子，进行体外转录获得的转录本具有异质性，病毒拯救效率较低。整个过程不仅操作步骤麻烦，而且耗时较长，成功率不高。

发明内容

本发明旨在建立一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，克服了现有技术中冠状病毒部分复制酶基因cDNA克隆在细菌中不能稳定保存的问题，克服了传统的酶切连接效率较低的问题，克服了体外转录导致的转录本异质性的问题。