[发明专利]一种用于磷酸肽富集和分离的离心式装置

说明书

本发明公开了一种用于磷酸肽富集和分离的离心式装置。所述离心式富集装置包括富集枪头、分离枪头和馏分收集器；富集枪头内填充有固相萃取膜片A和二氧化钛填料，固相萃取膜片A上覆盖有八烷基膜，固相萃取膜片A靠近富集枪头的出液口，分离枪头内填充有固相萃取膜片B和C18反相填料，固相萃取膜片B上覆盖有十八烷基膜，固相萃取膜片B靠近分离枪头的出液口；富集枪头可设置于分离枪头内；富集枪头和分离枪头均可与馏分收集器配合。本发明通过TiO₂富集枪头和C₁₈反相填料分离枪头将磷酸肽的富集和反相分离有机结合，有效精简了实验步骤，减少了样品损失；非常适合用于大规模、微量临床样品的磷酸肽分析，在蛋白质组翻译后修饰的富集研究中具有良好的应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种用于磷酸肽富集和分离的离心式装置，属于分析化学领域。

背景技术

磷酸化是蛋白质最常见的翻译后修饰之一，是指由蛋白激酶催化在底物蛋白质氨基酸残基上添加共价结合的磷酸根基团。其逆反应为由蛋白磷酸酶催化的去磷酸化过 程。蛋白激酶和磷酸酶独立工作，并在平衡中调节蛋白质的功能。有研究表明，在由 基因编码的蛋白中，约30％会发生磷酸化。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程 几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化，分子识别和信号传 导，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。蛋白质磷酸化在1906年由洛克菲 勒医学研究所的PhoebusLevene首次报道，他发现了磷酸化的卵黄蛋白。然而，直到 1954年，蛋白质的磷酸化过程才由Burnett和Kennedy报道发现。1955年Fisher和 Krebs揭示了可逆的磷酸化过程在生物调节机制中的重要性，并因此获得了诺贝尔生 理和医学奖。由于蛋白质磷酸化具有十分广泛而显著的生理意义，因此关于磷酸化的 研究成为蛋白质组学领域里重要的焦点之一。质谱是目前蛋白质组翻译后修饰鉴定研 究最有力的工具。然而目前以生物质谱为主要研究手段的磷酸化蛋白质组学研究还面 临着一系列技术挑战：磷酸化蛋白质在生物体内含量极低，研究认为，一般在某一特 定的时间，磷酸化的蛋白质相对于生物体的总体蛋白质而言，含量仅为2～3％；在质 谱检测时，大量的非磷酸化肽段会对磷酸化肽段的信号造成干扰和抑制；磷酸化肽段 具有负电性，在质谱分析常用的正离子模式下，离子化困难，信号会受到抑制。这些 问题都给磷酸化肽段的规模化鉴定带来不小的困难。因而在对较复杂的样本进行质谱 分析前，先对磷酸化肽段进行特异性的富集，提高其在样本中的含量，并去除非磷酸 肽的干扰，对于提高磷酸肽的分析灵敏度和鉴定规模就显得尤为重要。目前常用的磷酸肽富集方法主要有金属氧化物亲和色谱(MOAC)、固相金属离子亲和色谱(IMAC)、 离子交换色谱(SAX/SCX)等。金属氧化物亲和色谱的原理是利用过渡金属氧化物与 磷酸根的可逆结合选择性富集磷酸化肽段，常用的金属氧化物有二氧化钛(TiO₂)、二 氧化锆(ZrO₂)等。二氧化钛因其富集效果好、成本较低而得到了广泛应用。但其依 然存在一些问题：(1)所需样品起始量大，(2)实验步骤繁琐，极为费时费力，(3) 样品分析通量有限，(4)富集鉴定结果的重现性较差。此外，由于目前使用的生物质 谱仪器在扫描速度方面的局限性，富集后的磷酸肽样品一般需要经过反相色谱分离为 多个馏分，进一步降低样品的复杂程度后再进行质谱分析，从而可以有效提高磷酸肽 的鉴定规模。然而目前广泛采用的反相色谱柱式肽段分离模式，样本损失较大，而且 需要配合液相色谱仪器使用，样品处理通量有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于磷酸肽富集和分离的离心式富集装置，具有快速、操作简便、便于微量样本分析和高通量的特点，可平行处理多个样品。

本发明所提供的用于磷酸肽富集和分离的离心式富集装置，包括富集枪头、分离枪头和馏分收集器；

所述富集枪头内填充有固相萃取膜片A和二氧化钛填料，所述固相萃取膜片A 上覆盖有八烷基膜，所述固相萃取膜片A靠近所述富集枪头的出液口；