[发明专利]一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法。

背景技术

被子植物的花朵在大小、形态和颜色上千差万别。就形态而论，一朵花就是一个复合器官，其所有结构都与有性生殖过程相适应，所以植物的开花和结实特性是植物在一定生境条件下经过长期自然选择后的一种适应性表现，也是植物的花与其传粉者之间在生物界长期进化中，相互适应、相互协调的结果。了解植物的开花结实特性对研究物种濒危原因和以此制订合理的保护措施有重要的指导意义。

植物的繁育系统，作为物种性别表达中影响个体对下一代相对遗传贡献的首要因子，被认为不仅包含雌、雄配子等载体，是种群基因流动的途径，而且是受精成功的先决条件，是调节种群遗传结构的有效手段，它更深远的意义在于通过影响生殖成功来影响种群的动态和进化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法，该方法通过对凹叶木兰的开花物候、开花时花被片和雌雄蕊的动态变化、花粉维持活性的时间和柱头可受期的研究，探讨凹叶木兰的开花生物学特性和繁育系统。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，其技术方案具体为：

一种凹叶木兰的有性繁殖研究方法，包括以下步骤：

步骤1、开花结实的物候观察

在麻咪泽自然保护区，设置19个样地，按照人为干扰程度将样地的生境划分为村庄附近，放牧地，原始森林和人工林。连续两年于样地内进行凹叶木兰花期物候观测。按照Dafni(1992)的标准[353]记录开花进程并记录开始的时间，当个别植株开始开花时为始花期，50％以上的植株开花时为盛花期，少于10％的植株仍在开花为末花期。记录样地的海拔高度和经纬度。

于第一年年9月在美姑大风顶自然保护区，次年10月在雷波麻咪泽保护区和冕宁冶勒自然保护区，第三年10月在冕宁冶勒自然保护区进行凹叶木兰结实特性的调查，纪录每株凹叶木兰的结实数量，并测量结实的个体的高度和胸径。

步骤2、开花动态观察

从现蕾开始，随机标记凹叶木兰10朵花，每隔3个小时观察1次，记录花蕾的生长变化状态和开花动态，同时记录观察的时间、天气、湿度、温度。

步骤3、单花花粉量及花粉形态大小测定

从3株样树上随机选取外轮花被片已张开但雄蕊还未散粉的花20朵，固定于FAA溶液中带回实验室。在室内统计每朵花的花药数目后，从每朵花上随机选取5枚花药，用1.0mL/L HCl软化花药壁，解剖花药，将全部花粉移入装有蒸馏水的烧杯中，仔细清洗花药壁、镊子和刀片，清洗液也移入离心管，定容至100mL，振荡器下振荡60s，制成花粉粒悬浮液，用微量进样器取10μL花粉液于载玻片上，在显微镜下观察并统计花粉数，重复10次，取其平均值乘以10000算出5枚花药的花粉粒总数，并算出单花花粉量和平均单花花粉量。接着将该花的子房置于载玻片上于解剖镜下解剖剥离，统计胚珠数。每一朵花的花粉胚珠比(pollen ovule ratio，P/O)用单花中的花粉量除以单花子房中的胚珠数的方法统计。

在显微镜下观察木兰花粉的形态，用测微尺测量每朵花20粒花粉的大小。统计数据用平均值±标准误差表示，n表示样本量。

步骤4、花粉活力测定

在三棵样树上共选取10朵外轮花被片已开放至平展状态的花朵，采下带回室内水插，从其自然散粉开始到衰败时定期(1h、2h、3h、4h、8h、1d、2d、3d)取花粉测定。将花粉样品置于载玻片上，加1-2滴0.5％TTC(2.3.5-Triphenyl tetrazolium chloride)蔗糖溶液，在室温下放置10-15分钟后，用显微镜在同一张玻片的3个不同视野观察并统计花粉中红色花粉数所占总花粉数的比例，重复3次，取平均值。

步骤5、柱头可受期测定

人为将凹叶木兰花朵(或花蕾)分为I-IV个时期，取不同发育时期的花的花柱各20个(来源于不同的5朵花，每朵花取4个柱头)，在凹形载玻片内，用MTT(噻唑蓝)溶液对柱头进行检测。

进一步，步骤5中，花朵人为分期如下：

I：具有1层苞片的花蕾，苞片未开裂，褐色。

II：佛焰苞开裂至外轮花被片展开，中、内轮花被片略裂开，雄蕊未散粉。

III：中内轮花被片开放、雄蕊开始散粉。

IV：花被片、雄蕊开始脱落。

本发明具有以下有益效果：