[发明专利]基因重组的大肠杆菌及其在发酵制备芸苔素内酯中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因重组的大肠杆菌及其合成芸苔素内酯的方法。

背景技术

芸苔素甾醇（brassinoteroids，BRs）是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯之后发现的第六大类植物激素，对植物的生长发育具有重要的调控作用。BR在很低的浓度即明显地增加植物的营养生长和促进受精，通常以0.1～0.001mg/L浓度即可显示其很高的生理活性。其主要作用是提高坐果率，促进作物生长，提高结实率，增加千粒重及提高作物抗寒、抗病能力，减轻药害。

1970年，美国学者J.W.Mitchell等从油菜花粉中提取出一种具有强生理活性物质，对植物茎的伸长和细胞分裂有强烈的促进作用，定名为油菜素，又称芸苔素(Brassins)。1979年美国学者Grove利用蜜蜂采集的方法收获了227公斤的油菜花粉，提纯了4mg的油菜素，通过仪器分析确定其化学结构属于甾醇内酯，故命名为油菜素内酯(Brassinolide，BL)。迄今发现了大约70种天然芸苔素内酯类化合物,被合称为油菜素甾醇类物质（brassinosteroid，BR）。BR在植物中广泛存在，由于它们的功能与BL相似，因此BR成为了油菜素甾醇类物质的代称，而BL是油菜素甾醇类成员中活性最强的一种分子。

从90年代中期开始，研究者们对拟南芥、豌豆、西红柿、水稻等植物中发现的BR突变体进行生理生化、分子遗传等方面的研究，促进了我们对BR合成和促进的认识。BR在植物体内合成以甲羟戊酸为前体，经过甾醇合成途径转化为油菜甾醇。从油菜甾醇转化为BR，由早期和晚期C-22氧化途径、早期和晚期C6氧化途径、早期C-22氧化途径和晚期C-6氧化途径之间的合成捷径组成。迄今为止，研究者们已经从植物中克隆了24个BR合成基因和6个BR代谢基因，这些基因编码的酶可催化BR合成途径的反应步骤。

早在1985年科研工作者就开始进行芸苔素内酯的化学合成。芸苔素内酯由麦角甾醇通过甲磺酰化反应制得麦角甾醇甲磺化物，水解得异麦角甾醇，氧化反应制得相应的烯酮，还原制得酮，开环得二烯酮，羟基化得四羟基酮，扩环制得芸苔素内酯。化学合成芸苔素内酯反应过程需强氧化剂及还原剂参与。

发明内容

本发明的目的是提供一种可发酵制备芸苔素内酯的基因重组的大肠杆菌BL21(DE3)-BL。

本发明的另一目的是提供基因重组的大肠杆菌BL21(DE3)-BL 在制备芸苔素内酯中的应用。

本发明是这样实现的：

1. 基因重组的大肠杆菌BL21(DE3)-BL，由大肠杆菌BL21(DE3)携带的CYP90B1、CYP90C1、CYP85A2三个目的基因的重组质粒pET-28a-CYP90B1、pET-28a-CYP90C1、pET-28a-CYP85A2构成。导入的目的基因CYP90B1、 CYP90C1 、CYP85A2的mRNA碱基序列和氨基酸序列分别见序列表中的序列1和2， 3和4， 5和6。该基因重组大肠杆菌的中文命名：大肠埃希氏菌，拉丁文名：Escherichia coli，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期：2017年5月27日，保藏编号：CGMCC No.14203。

2．基因重组的大肠杆菌BL21(DE3)-BL，制备方法如下：

（1）提取油菜植株各器官的总RNA；

（2）将油菜植株总mRNA反转录，产物即为油菜植株的cDNA文库；

（3）目的基因引物设计及pGEM-T easy重组质粒构建。三个基因引物分别为：

CYP90B1上游引物：5‘-GAATTCATGTTCGAAACAGAGCATC-3’（EcoR1）

下游引物：5‘-CCGCTCGAGGCCACAGAATACGAGAAAC-3’（Xho1）

CYP90C1上游引物：5‘-GGATCCCGTATGCAACCTCCGGC-3’（BamH1）

下游引物：5‘-TAAAGCGGCCGCAATGATCTTCAAGTGAG-3’（Not1）

CYP85A2上游引物：5‘-CGGGATCCCGGATGGGCATAATG-3’（BamH1）