[发明专利]血清中柠檬酸定量测定方法及其在糖尿病肾病早期诊断中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及血清中柠檬酸水平作为糖尿病肾病早期诊断标记物的应用及其测定方法。

背景技术

糖尿病肾病(DN)是糖尿病微血管并发症之一，是糖尿病患者的重要死亡原因。据统计，大约有1/3的糖尿病(DM)患者会发展成糖尿病肾病，而糖尿病肾病导致的死亡概率是普通肾病的17倍。糖尿病肾病是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一，早期的介入和治疗可以延缓糖尿病肾病的发展、减少治疗费用、降低疾病死亡率，因此寻找糖尿病肾病的早期诊断标志物成为治疗糖尿病肾病的关键所在。微量白蛋白尿仍是诊断DN并判断进展的主要临床指标，但是，出现微量白蛋白尿是否就肯定进入临床DN？有人对386例2型糖尿病伴微量白蛋白尿的患者随访12年，发现仅有30％的微量白蛋白尿患者发展为确诊的糖尿病肾病。现有的指标(如反映肾脏损伤指标、肾功能指标、足细胞损伤指标以及细胞外基质指标等)很少是DN的特异性标志物，因此在临床实际应用中尚难令人满意。其他研究报道的糖尿病肾病的早期诊断标记物有中性粒细胞载脂蛋白(NGAL)、肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、免疫球蛋白轻链(FLC)以及α-1-酸性糖蛋白(AGA)等。然而，针对所提出来的标记物用于早期诊断DN并无后续验证以及临床上的应用。因此，需要寻找更敏感、特异且临床应用可靠的早期诊断标记物。

近年来，利用系统生物学技术，人们发现了一些新的生物学标志物，对DN的诊断提供了帮助。前期研究发现DN动物模型db/db小鼠血清中柠檬酸水平在DN早期显著升高，因此，提出血清中柠檬酸水平可作为早期糖尿病潜在诊断标记物加以研究。本发明开发了一种用¹³C标记的柠檬酸替代血清中内源性柠檬酸的替代分析物的GC/MS定量方法，并进行了全面的方法学验证，成功用于准确定量人血清中内源性柠檬酸。通过ROC曲线分析发现血清中柠檬酸对尿白蛋白阴性的DN病人的诊断百分比高达90％以上，可作为潜在的糖尿病肾病早期诊断标记物用于临床上进一步研究。

发明内容

本发明建立了一种¹³C标记的柠檬酸(¹³C₆-柠檬酸)替代血清中内源性柠檬酸的替代分析物的GC/MS定量方法，在已建立的GC/MS代谢组学平台上采用SIM扫描模式进行检测。首先测定替代分析物和真正分析物响应因子(RF)以消除同位素效应和离子化效率的差异。测定结果显示在线性范围内响应因子的值恒定且趋近于1，由此说明可以用血清中系列浓度的¹³C₆-柠檬酸建立标准曲线用于定量内源性柠檬酸。然后依照分析方法指导原则，从选择性、定量下限及线性范围、准确度与精密度、提取回收率与基质效应对本测定方法进行了全面的方法学验证，实验结果表明，¹³C₆-柠檬酸特异性良好，定量下限为1μg/mL。人血清中¹³C₆-柠檬酸在1.0-200.0μg/mL范围内线性良好，相关系数r＞0.99。批内和3日内批间差在85％-115％之间，介质效应均在可接受范围(85％-115％)，提取回收率均＞70％，所建立的方法符合生物样本的测定要求，解决了柠檬酸这一内源性物质定量的难题。

将所建立的内源性柠檬酸的定量方法用于测定健康受试者以及尿白蛋白阴性(UAE-)、尿白蛋白阳性(UAE+)和大量白蛋白尿(Pro)三个不同组别DN病人血清中柠檬酸，发现三组DN病人血清中柠檬酸水平都显著高于正常组，ROC曲线下面积分别为0.946，0.894和0.983，提示血清中的柠檬酸水平对早期DN具有极高的预测性。此外，根据测定结果划定了每个组别受试者血清中柠檬酸分别于90％和95％置信区间的浓度范围，为临床应用提供参考。

本发明的有益效果：

本发明建立了一种方便可靠且重复性好的血清中内源性柠檬酸的定量方法，并成功应用于测定正常受试者以及DN病人血清柠檬酸水平，通过ROC曲线分析得出其诊断百分比高达90％以上，具有极高的预测性，有一定临床参考价值。

附图说明

图1：¹³C₆-柠檬酸与柠檬酸GC/MS全扫描质谱图

a：柠檬酸质谱图；

b：¹³C₆-柠檬酸质谱图。

图2：特异性色谱图

a：人空白血清与血清中的¹³C₆-柠檬酸(1μg/mL)对比色谱图；