[发明专利]一种快速制备糖芯片的方法

说明书

本发明公开了一种将糖探针简单快速地固定在芯片表面的方法，其特征是包括如下步骤：在室温下，一定浓度和pH条件下，通过方酸二乙酯的连接作用，直接在吸附有牛血清蛋白单层的芯片上原位特异性地固定糖探针，即可得到性能优良的糖芯片；该方法制备简单方便，无需纯化终产物，适合大批量生产的需要，应用前景非常广阔。

技术领域

本发明涉及一种将糖探针简单快速地固定在芯片表面的方法，用于方便地制备高性能的糖生物芯片，属于生物检测技术领域。

背景技术

糖类化合物是许多生物分子的组成结构之一，并且大量存在于细胞表面和细胞内，在细胞识别和免疫，细胞新陈代谢等生物行为中起到了至关重要的作用。糖芯片起源于DNA或蛋白质芯片的研究，技术成熟，是目前分析糖和各种生物物质(如凝集素、细菌、病毒、抗体等)之间相互作用的有效工具，近年来已成为生物学和生物医学研究的重要检测手段。

糖探针在材料表面高效、快速且稳定的固定是制备糖芯片的重点。分子量较大的多糖探针虽然可以通过疏水相互作用或范德华力较容易的吸附在芯片表面，但对于单糖或者二糖这类小分子糖类，无法直接固定在传感器表面，需要在糖的端基修饰上-SH、-NH₂等功能基团，以共价或非共价的形式固定在同样经过修饰的芯片表面；也可以合成各种糖复合物(如树枝状高分子、DNA、脂类等)固定在芯片表面。而为了更好的模拟生物体内的糖结构，有时我们还希望对芯片表面上糖探针的数量和分布得到控制。通过原子转移自由基聚合(ATRP)，在芯片表面形成聚合物刷可以实现这一目的。但由于制备过程较为繁琐，且合成聚合物刷的过程需要合适的单体材料和特定的催化剂，应用有一定局限性。

在芯片表面修饰氨基、羧基等反应基团，然后通过共价作用将糖衍生物固定在芯片表面是目前制备单糖芯片比较成熟的方法。为了增加芯片在检测时的抗非特异性吸附，通常还需要再将芯片浸泡在一定浓度的牛血清蛋白(BSA)溶液中，防止芯片在检测时的非特异性结合。这种方法虽然可以将单糖探针牢固的固定在芯片表面，但糖探针在材料表面的分布具有随机性，且糖探针仅分布于二维平面内。该方法限制了其在生物检测的应用，因为许多生物相互作用行为具有多价效应，这要求我们对糖探针的分布进行有效地控制。

在此，我们提出一种将糖探针简单快速地固定在芯片表面的新方法。利用BSA在各种材料(金、玻璃、聚苯乙烯等)表面良好的吸附能力，直接将BSA吸附于材料表面，其可以自组装形成BSA单层。该BSA单层不仅可以防止生物检测过程中的非特异性吸附，而且BSA表面暴露的氨基可以作为特异性的结合位点结合糖探针。通过方酸二乙酯的连接作用，将BSA表面的氨基和氨基化的糖探针在室温下即可形成稳定的连接，即制备出所需的单糖芯片。该方法对单糖的种类没有要求，直接在芯片上原位特异性地固定糖探针，即得到糖芯片。制备简单，无需纯化终产物，适合大批量生产的需要，应用前景非常广阔。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的简单、快速制备高性能单糖芯片的技术。

本发明的技术原理

在一定pH条件下，可以通过方酸二乙酯的连接作用，将氨基化的单糖衍生物直接和牛血清蛋白上的氨基进行生物偶联反应。而该偶联反应的效果和牛血清蛋白在芯片表面的覆盖密度、糖衍生物的浓度、反应时间有关。因此，可以通过优化上述反应条件，用简单快速的方法制备出高性能的单糖芯片。

为实现上述的目的，本发明采用的技术方案是：

(1)单糖衍生物和方酸二乙酯的连接

将氨基化的糖衍生物溶于pH＝7的磷酸盐缓冲液中，然后向溶液中加入一定量的方酸二乙酯，在室温下缓慢搅拌14h。反应结束后，真空蒸发掉溶剂，使用快速柱层析的方法纯化得到一端接有方酸二乙酯的糖衍生物。

(2)牛血清蛋白单层的制备