[发明专利]基于16SrRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定方法和专用引物

说明书

本发明公开了一种快速检测食品中鹌鹑源性成分的方法及专用引物。专用引物见序列表SEQ ID NO 1‑2。针对以鹌鹑肉源DNA为阳性模板，牛、羊、猪、兔、鸽、鸡、鸭和鹅8个物种的DNA为干扰模板的混合模板，分别进行PCR和qPCR反应。其中PCR方法的结果以琼脂糖凝胶电泳图谱中电泳条带为阳性结果，而qPCR方法中以扩增曲线的Ct值小于34的扩增作为阳性结果，检测灵敏度达皮克级DNA。该方法首次利用16S rRNA为目标基因对深加工鹌鹑肉进行检测，所设计引物同时适用于PCR和qPCR方法中，不仅具有良好的特异性，且高度的灵敏性为食品中动物源性成分的鉴定探索了新的途径，具有操作便捷，稳定准确等有益结果。

技术领域

本发明属于食品质量安全检测技术领域，尤其涉及鹌鹑特异性PCR扩增鉴定畜禽肉中鹌鹑肉源性成分。

背景技术

近年来，动物源性食品掺杂掺假、以次充好、以廉价劣质的畜禽肉替代高价优质畜禽肉等各种食品安全事件频发，严重扰乱了市场秩序，侵害了生产者和消费者的合法利益，同时带来了严重的食品安全隐患。在西方，一项对近千种肉制品的检测分析表明，有近20％的产品存在标识与品种不完全相符的现象。

鹌鹑属于鸡形目最大的特点就是耐粗饲，抗病能力强，出栏快，产蛋率高，易管理等等很多优点，很多人都饲养鹌鹑，因此市场上常会利用家养鹌鹑冒充野生麻雀、鸽子或其他野生鸟类的不法行为。研究动物源性食品安全检测技术，对食品动物源性成分进行鉴定，显得尤为重要。PCR技术由于其操作简便、快速高效等特点，已在国外肉类掺假研究中得到广泛应用，并取得一些创新性成果。动物线粒体基因组DNA作为核外遗传物质，无论是在种间还是种内都具有广泛的多态性，是设计肉类成分定性检测的首选靶点，包括细胞色素b(Cyt b)基因、细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(COX1)基因、16S rRNA、D-Loop基因等，在这些基因中16S rRNA在线粒体基因组中属于进化速率较慢的，更有利于肉类成分的定性检测。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种PCR检测肉类中鹌鹑源成分鉴定的方法及专用引物，操作简便、快速，检测结果准确的分析肉质中鹌鹑源成分，该方法首次利用16S rRNA为目标基因对深加工鹌鹑肉进行检测，所设计引物同时适用于PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)方法中，不仅具有良好的特异性，且高度的灵敏性为食品中动物源性成分的鉴定探索了新的途径，具有操作便捷，稳定准确等有益结果。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案实现的，基于16S rRNA鹌鹑肉源成分PCR扩增鉴定专用引物对，其核苷酸序列为：

所述引物对的上游引物序列为：5‘-AAGGATACCACAATTTAAC-3’，

所述引物对的下游引物序列为：5‘-AGAGGGAAGGTAGTGTT-3’。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案实现的，一种PCR检测肉类中鹌鹑源成分鉴定的方法：分别提取鹌鹑肉样本DNA作为阳性对照样本和待测肉样DNA并稀释到同一浓度；利用所述PCR扩增鉴定专用引物对鹌鹑肉样本DNA和待测肉样DNA同时在相同条件下进行PCR 扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，以鹌鹑肉样本DNA琼脂糖凝胶电泳图谱中118bp电泳条带为阳性结果；将待测肉样DNA其PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱与阳性结果进行比对，如果待测肉样DNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱中出现电泳条带118bp 并与阳性对照样本条带亮度相同，认定待测鹌鹑肉为纯正鹌鹑肉，反之，则是掺假鹌鹑肉。

优选的，所述PCR扩增反应体系为：2×PCR Mix 10μl，10mol/μl上游引物0.2μl，10mol/μl 下游引物0.2μl，20ng/μl模板DNA或者待测肉样DNA 1μl，灭菌双蒸水8.6μl。

优选的，所述PCR扩增的反应程序为95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s 此过程经过30个循环，最后72℃延伸5min。