[发明专利]鉴别诊断NOA患者睾丸内残存精子的试剂及miRNA在其中的应用

说明书

本发明涉及miRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用；还涉及一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂和试剂盒。将所述miRNA作为分子标志物，通过检测其表达水平来诊断NOA患者睾丸内是否存在精子，从而预先判断NOA患者通过micro‑TESE等方法手术取精成功率，可避免大约60％左右的NOA患者进行不必要的外科手术和睾丸创伤，具有较大的社会效益和经济效益。

技术领域

本发明涉及人类生殖健康领域，更特别地，涉及miRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用，还涉及用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂和试剂盒。

背景技术

不孕不育是一类常见的生殖疾病，在育龄夫妇中的发病率约为15％。男性不育症中，最严重的一类是无精子症，约占育龄男性人口的1％。在所有导致男性的不育病因中，精子发生障碍是最为常见的因素，也是成年男性生殖健康面临的最主要威胁之一。精子发生障碍是一个多因素、多阶段的过程，主要临床表现为射出精液中精子密度的降低，按WHO标准可分为少精子症、无精子症等(WHO定义的无精子症为：三次精液常规分析，显微镜检查精液标本未见精子，经3000g离心15min，仍无精子)。其中非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia，NOA)约占无精子症的60％，梗阻性无精子症(obstructiveazoospermia,OA)约占40％。

微小核糖核酸(miRNA)是一类小分子非编码单链RNA，长约19-25个核苷酸，通过与靶mRNA的3'非翻译区(3'UTR)互补配对，使靶mRNA降解或使其翻译受到抑制，从而在转录后水平对生物体内基因时序性表达起到精细调节作用。据估计，人体内约1/3的基因受miRNA调控。它与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。最近的研究表明，miRNA能够游离于细胞之外，稳定存在于血浆、精浆以及其他体液中，具备疾病分子生物学标志物的某些优点，已在多种肿瘤和非肿瘤疾病的诊断和预后中显示了其独特的价值，如：恶性肿瘤,产前诊断,法医鉴定,糖尿病,药物诱导的肝损伤,组织损伤,心血管疾病等。此外，miRNA与男性生殖也密切相关，在精子发生过程中发挥重要的表观遗传学调控作用。

有研究发现，大约30～40％NOA患者睾丸组织中还残存有少量的“局灶性”精子发生，可以找到少量睾丸内残存精子，并借助于辅助生殖技术生育自己的遗传学后代。因此，目前对于NOA的处理方法主要是通过外科睾丸显微取精术(micro-dissection testicularsperm extraction,micro-TESE)配合辅助生殖技术(assisted reproductivetechnology，ART)来达到生育自己遗传学后代的目的。

然而，迄今报道的micro-TESE获取精子成功率大约只有40％左右，其原因在于，大部分NOA患者的睾丸组织中没有睾丸内残存精子。micro-TESE手术需要切开睾丸并分离睾丸组织查找极为少量的具有一定精子发生能力的生精小管，对睾丸组织的创伤相对较大，可能破坏睾丸的血供，甚至形成瘢痕粘连，严重时甚至可能导致术后睾丸萎缩。对于没有睾丸内残存精子的NOA患者而言，进行micro-TESE手术不利于患者的身体健康。

然而，迄今尚无手术前预判睾丸内残存精子的非损伤性检测指标，也没有使用miRNA作为NOA患者睾丸内残存精子的预判指标的任何报道。

由于大部分NOA的病因尚不清楚，还缺乏有效的治疗手段。大多数NOA病人只能盲目选择micro-TESE和辅助生殖技术，这会给大部分病人造成不必要的身体上的伤害、心理上和经济上的负担。能否术前预判NOA患者睾丸睾丸内残存精子是本领域亟待解决的问题，也是精准医疗的发展方向。

因此，需要找到非损伤性、高灵敏性以及高特异性的生物学标志物，这些新的标志物及其指标变化可以作为NOA患者micro-TESE能否找到精子的预判指标。

发明内容