[发明专利]一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料及其制备方法

说明书

本发明一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料及其制备方法，将哺乳动物任意卵巢组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞卵巢材料；本发明在去除具有免疫原性的异体或异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常卵巢的复杂组织结构。

技术领域

本发明主要涉及用于组织或器官修复及其再生的生物领域，具体是一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料及其制备方法。

背景技术

卵巢早衰可以是自发的或是医源性的。当前的治疗手段包括激素替代疗法和低温储藏技术，它们可能增加卵巢癌的风险，在自体再移植后诱导产生恶性细胞，使得生存率大大降低。

脱细胞技术作为一种新兴的再生医学和组织工程技术，在去除了免疫原性细胞的同时，保留了天然的3D微结构以及细胞外基质中的有效成分胶原，糖胺聚糖(GAG)，细胞因子等，为细胞种植提供优良的载体，使得卵巢再生成为可能。

发明内容

本发明提供了一种适宜的脱细胞卵巢材料的制备方法，目的在于改进现有技术中，卵巢早衰疗法的缺陷，提高患者预后。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：将哺乳动物任意卵巢组织经含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液、有机溶剂溶液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液和含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得脱细胞卵巢材料；

其中含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液浓度为1％-3％，蛋白酶抑制剂含量为10KIU/ml；

所述的有机溶剂溶液为三种溶液中的一种，三种溶液分别为等体积比的氯仿和甲醇溶液，质量浓度10％-50％的丙酮溶液，质量浓度10％-50％的乙醇溶液；

所述的含Triton X的PBS缓冲液的质量浓度1％-5％的Triton X-200或Triton X-100的PBS缓冲液；

所述的含SDS的PBS缓冲液为浓度0.5％-1％的SDS的PBS缓冲液，其中混合1-5mmol/L的Tris；

所述的含DNA酶的PBS缓冲液中DNA酶浓度为0.05-0.3mg/ml。

一种天然组织来源的卵巢脱细胞材料的其制备方法，包括以下步骤：

(1)取哺乳动物卵巢组织，用无菌生理盐水漂洗3次、20分钟/次，去除血液、残余肌肉组织和韧带组织；

(2)将卵巢组织在-80℃和37℃的环境中冻融，循环3次，切片至1-2mm；

(3)在含蛋白酶抑制剂的生理盐水缓冲液中，恒温37℃摇床100rpm震荡5-10小时；

(4)在有机溶剂溶液中，恒温37℃摇床100rpm震荡脱脂2-5小时；

(5)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡6-12小时；

(6)在含SDS的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，恒温37℃摇床100rpm震荡2-5小时；

(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入青霉素和链霉素混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡2-10小时；

(8)在无菌生理盐水中，37℃摇床100rpm震荡5小时，即得天然组织来源的卵巢脱细胞材料。

混合抗菌液中青霉素和链霉素的浓度分别为10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和链霉素的比例为1:1；步骤(5)-(7)中PBS缓冲液和混合抗菌液体积比分别为10:1、10:1、5:1。