[发明专利]一种检测血浆游离DNA中KRAS基因突变的试剂盒及方法在审
| 申请号： | 201710498967.0 | 申请日： | 2017-06-27 |
| 公开（公告）号： | CN107151706A | 公开（公告）日： | 2017-09-12 |
| 发明（设计）人： | 罗迪贤;罗伟濠;肖莉;蒲汪旸;胡政;贺荣章;李佳;段丽丽;刘璇;王凤娇;张佳;李凯 | 申请（专利权）人： | 郴州市第一人民医院 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 长沙正奇专利事务所有限责任公司43113 | 代理人： | 马强,周栋 |
| 地址： | 423000 *** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 检测 血浆 游离 dna kras 基因突变 试剂盒 方法 | ||
1.一种检测血浆游离DNA中KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有特异性引物对和耐高温的限制性内切酶；所述特异性引物包括序列如SEQ ID NO.1所示的正义引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反义引物；所述耐高温的限制性内切酶BsrⅠ内切酶。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有高保真DNA聚合酶和PCR常规组件。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶为HotStarTaq Plus DNA聚合酶。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR常规组件包括dNTP混合液、含镁离子的PCR反应缓冲液、去离子水。
5.基于权利要求1至4任一项所述试剂盒检测血浆游离DNA中KRAS基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取血浆游离DNA；
(2)采用权利要求1至4任一项所述试剂盒进行PCR反应；
(3)将步骤(2)获得的PCR产物送去一代测序，并通过与GeneBank中记录的序列做BLAST一致性分析，判断突变情况。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述进行PCR反应的具体过程为：a)采用试剂盒中的特异性引物对、高保真DNA聚合酶、PCR常规组件构成的PCR反应体系，进行PCR反应；b)在PCR反应过程中加入试剂盒中的耐高温的限制性内切酶，并于65℃酶切反应1h；c)酶切反应结束后继续进行PCR反应。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤a中所述PCR反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c中所述PCR反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5min。
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