[发明专利]新型抗菌肽DLP2的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种新型抗菌肽DLP2的制备方法。

背景技术

黑水虻抗菌肽DLP2是Sung Moon Yoe研究组以黑水虻(亮斑扁角水虻，Hermetia illucens)为原料，通过金黄色葡萄球菌(S.aureus KCCM 40881)进行免疫刺激从而产生的高效抗G⁺菌活性抗菌肽。抗菌肽DLP2是含有95个氨基酸残基的多肽序列，其中1～24位是信号肽序列，25～40位为前导肽序列，41～81位为成熟肽(DLP2)序列。DLP2理论分子量分别为4277.0Da，分子中具有2个组氨酸(His)和1个赖氨酸(Lys)以及5个精氨酸(Arg)，在不同pH环境中，由于组氨酸解离状态不同，净电荷数在+2到+4之间变化(Soon-Ik Park等，Park S I,Kim J W,Yoe S M.Purification and characterization of a novel antibacterial peptide from black soldier fly(Hermetia illucens)larvae.[J].Developmental&Comparative Immunology,2015,52(1):98-106.)。

抗菌肽替代传统抗生素应用于由细菌感染所引起的各种疾病一直备受科学界关注，也是人类对抗各种病原菌的有效武器。抗菌肽抗菌谱过宽，稳定性不好，具有细胞毒性，抗菌活性不足，用药多样性，生产成本高(基因克隆表达产量太低和化学合成成本过高)等一直是抗菌肽应用中面临的挑战。目前，尚未见到有关于DLP2在毕赤酵母中进行转基因表达的报道。

发明内容

本发明的目的是提供新型抗菌肽DLP2的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种可高效分泌表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌。

为了实现本发明目的，本发明提供的新型抗菌肽DLP2的制备方法，包括以下步骤：

1)基因表达框的设计：对抗菌肽DLP2的编码基因进行酵母偏爱密码子优化，在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA和TAG终止子序列以及XbaI酶切位点，所得基因表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

2)重组酵母表达载体的构建：将SEQ ID No:3所示的基因经XhoI和XbaI双酶切后，与经过同样双酶切的pPICZαA载体连接，得到的重组酵母表达载体pPICDLP2；

3)重组酵母菌的制备：载体pPICDLP2经线性化后转化感受态毕赤酵母X-33，筛选出高水平表达抗菌肽DLP2的重组酵母菌；

4)抗菌肽DLP2的制备：对步骤3)中获得的重组酵母菌进行发酵培养，通过补加葡萄糖和甲醇诱导，获得发酵液，离心收集上清，上清经纯化后即得抗菌肽DLP2。

前述的方法，步骤4)具体为：

①种子液制备：

挑取单菌落接种于YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养18～24h；然后按1％的接种量，转接至YPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养16～18h，OD₆₀₀达到4～6；然后，按10％接种量接到上罐培养基(含4.8‰PMT1)中，即200ml菌液+200ml 45％葡萄糖+9.6ml PMT1，装液量为2L/5L，于29℃，800rpm，pH 5.0，pO₂>35％的条件下培养16-18h；

②添加葡萄糖生长阶段：

观测发酵液的溶氧值开始缓慢下降后突然上升，开始补加含12‰PMT1的50％葡萄糖溶液，添加时间6-8h，流速为30ml/L/h；

③甲醇过渡诱导：

添加葡萄糖6h后，饥饿1h，待葡萄糖耗尽后，开始补加含12‰PMT1的无水甲醇，补加过程中，流速由第1小时1ml/L/h逐渐增加到第6小时6ml/L/h，直至发酵结束；

④100％甲醇诱导阶段：

甲醇过渡诱导6h后，开始100％甲醇连续诱导，流速为6ml/L/h；甲醇诱导开始后，每12h取样，测定重组酵母菌分泌表达抗菌肽DLP2的水平。

前述的方法，步骤4)中采用阳离子交换层析对上清进行纯化。具体操作如下：