[发明专利]基于transwell和uptake技术体外检测OTA转运的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种基于transwell和uptake技术体外检测OTA转运的方法。

背景技术

赭曲霉毒素A(OTA)是一种由青霉属(Penicillium.sp)和曲霉属(Aspergillus.sp)真菌产生的次级代谢产物。OTA污染范围广，包括小麦、大豆、玉米、燕麦、大麦、咖啡豆、肉、乳酪等。1989年，美国国家毒理学计划发表声明，认为OTA是真菌毒素中最强的肾致癌物质，可以导致全部哺乳动物肾毒性。OTA与人的肾病相关，是巴尔干肾病的可能诱因，动物实验报道OTA的暴露与尿道癌、肝癌、乳腺癌有因果联系。另外，OTA还具有肝毒性、生殖毒性、神经毒性、免疫毒性等多种毒性。

经典的OTA肾脏转运系统中，OTA分泌主要是通过近端小管的有机阴离子转运系统，分泌的OTA被近端小管、末端小管、收集管重吸收，导致OTA在近端小管细胞的积累。ABC(ATP-binding cassette)转运体是广泛分布在多个组织的跨膜蛋白。在OTA的研究中，ABC家族的两个成员是潜在的OTA转运蛋白，多药耐受相关蛋白2(MRP2)和乳腺癌耐受蛋白(BCRP)。它们位于肝细胞、肾近端小管、肠细胞顶膜，是外排蛋白。有研究表明OTA抑制MRP2介导的PAH转运，OTA本身也是MRP2的底物。前人用Caco-2细胞研究报道OTA可能是BCRP的底物。但是对于它们能否转运OTA存在争议。目前的研究认为有机阴离子转运多肽(OATPs)，尤其是OATP1A/1B家族对药物、分子在机体内的分布、排泄起作用。它们主要在肝、肾、小肠中表达，人OATP1B1和OATP1B3主要在肝细胞基底膜表达。人OATP1A2主要在顶膜表达，包括肠上皮细胞，远端肾单位细胞等。人OATP2B1广泛分布在肝细胞基底膜，肠细胞顶膜等。之前的报道称Oatp1a1、Oatp1a3v1、Oatp1a3v2和Oatp1a4能介导OTA的转运，但都是大鼠或小鼠的蛋白。对于OTA如何进入肾脏、肝脏，进而损伤靶器官，或者OTA是如何从脏器中排出，进而排出体外，至今尚无确切结论。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于transwell和uptake技术体外检测OTA转运的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于研究OTA转运的细胞模型，包括过表达基因mBcrp、hBCRP、mMrp2、hMRP2、OATP1B1、OATP1A2或OATP2B1的细胞系；所述细胞系是通过基因工程手段将上述基因分别构建到表达载体上，得到重组表达载体，然后将各基因对应的重组表达载体转入肾脏、肝脏或肠组织来源的细胞系中，构建得到过表达上述各基因的细胞系。

本发明所述肾脏来源的细胞系包括但不限于MDCK-Ⅱ或HEK293。

本发明中使用的细胞模型均由荷兰癌症研究所Alfred Schinkel实验室提供。参见Lagas J S,Cm V D K,Van d W K,et al.Transport of diclofenac by breast cancer resistance protein(ABCG2)and stimulation of multidrug resistance protein 2(ABCC2)-mediated drug transport by diclofenac and benzbromarone.[J].Drug Metabolism&Disposition the Biological Fate of Chemicals,2009,37(1):129-136.

Zimmermann C,Van d W K,Van d S E,et al.Species-dependent transport and modulation properties of human and mouse multidrug resistance protein 2(MRP2/Mrp2,ABCC2/Abcc2).[J].Drug Metabolism&Disposition the Biological Fate of Chemicals,2008,36(4):631-640.

本发明还提供一种基于transwell技术体外检测OTA转运的方法，利用上述细胞模型，向细胞培养液中添加OTA，孵育一段时间后，通过检测细胞培养液中OTA的含量变化，从而分析蛋白mBcrp、hBCRP、mMrp2或hMRP2对OTA的转运能力。