[发明专利]一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、抽取一定量脐血样本，进行传染病六项检测；

S2、将通过六项检测后的脐血样本进行冻存细胞制品检定；

S3、进行发放(复苏)细胞检定；

S4、按要求完成包装、冻存、运输及有效期的标定。

2.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法，其特征在于，所述六项检测包括HbsAg、抗-HCV、梅毒螺旋体抗体、抗-HIV、巨细胞病毒和ALT的检测；其中前四者采用酶联免疫法检测，检测结果应为阴性；巨细胞病毒采用酶联免疫法检测，IgG和IgM的检测结果应为阴性；ALT采用速率法检测，检测结果应≤40单位。

3.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括如下步骤：

S21、细胞活率的检测；

S22、通过倒置显微镜进行细胞形态的观察，收集的贴壁细胞应为成纤维状梭形细胞；

S23、间充质干细胞表型特征的检测

将样本按条码号顺序排列好，每份样本按照检测抗体种类的需要取流式专用管若干支，分别标记好同型对照管和抗体管；将样本移入专用流式管，500g离心5分钟；弃上清，再加入1ml PBS，充分混匀，500g离心5分钟，弃上清，再加入适当体积的PBS悬浮细胞沉淀；在两管中分别加入样本100μl细胞悬液；在相应的管中分别加入相应量抗体以及相应的同型对照试剂；充分混匀，置4℃冰箱避光孵育30分钟。加入1ml PBS，充分混匀，500g离心5分钟；弃上清液，然后加入1mL PBS清洗，充分混匀，500g离心5分钟；弃上清液，加入适量PBS，充分混匀，调整细胞至合适浓度，随后上机检测；在复苏冻存细胞直接检测或必要时复苏冻存细胞再培养72h后检测中，至少有一个检测点的结果应完全符合以下要求：阳性抗原：CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，阳性指标表达率≥95％；阴性抗原：CD14，CD19，CD34，CD45，HLA-DR，阴性指标表达率≤2％；

S24、取细胞末次洗涤上清液30ml，依《无菌检测标准操作程序》中血培养仪检测法进行无菌检测，检测结果应符合规定；

S25、取细胞悬液100μl，依《支原体检测标准操作程序》进行支原体检测，检测结果应符合规定；

S26、内毒素检测：取细胞悬液0.5ml，依《内毒素检测标准操作程序》检测，应符合规定；

S27、取细胞悬液，依《核型分析标准操作程序》进行核型分析，细胞应在染色体水平保持稳定；

S28、取细胞悬液，依《基因组甲基化检测标准操作程序》进行基因组甲基化检测，基因组的甲基化水平应无变化；

S29、取细胞悬液，依《端粒酶活性检测标准操作程序》进行端粒酶活性检测，细胞端粒酶活性应无变化。

4.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括如下步骤：

S31、消化收集细胞，以氯化钠注射液制成终浓度为1～2×106/ml的单细胞悬液，吸取10μl台盼蓝溶液与10μl样品混合后吹打均匀，取10μl混合悬液，与计数板成斜45度角注于盖玻片边缘，重复该动作，将计数板的另一个小室用余下的10μl细胞悬液充满；将计数板平放在显微镜的载物台上计数；单室计数细胞不得少于400个；观察蓝染细胞占总细胞数比例。蓝染细胞数应小于15％，细胞活率应大于85％；

S32、取细胞末次洗涤上清液30ml，依《无菌检测标准操作程序》中血培养仪检测法进行无菌检测，结果应符合规定；

S33、每次发放的细胞，分装结束后，从最后一步分装容器中取残余的细胞悬液少许，进行革兰氏染色检测，应无革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

5.如权利要求3所述的一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法，其特征在于，所述步骤S21采用台盼蓝染色法，具体包括如下步骤：消化收集细胞，以氯化钠注射液制成终浓度为1～2×10⁶/ml的单细胞悬液，吸取10μl台盼蓝溶液与10μl样品混合后吹打均匀，取10μl混合悬液，与计数板成斜45度角注于盖玻片边缘，重复该动作，将计数板的另一个小室用余下的10μl细胞悬液充满；将计数板平放在显微镜的载物台上计数；单室计数细胞不得少于400个；观察蓝染细胞占总细胞数比例；蓝染细胞数应小于15％，细胞活率应大于85％。

6.如权利要求3所述的一种脐带间充质干细胞制剂质量的评估方法，其特征在于，所述步骤S21采用CASY-TT快速细胞分析仪检测，细胞活率应大于85％。